我们今天看的这篇文章依旧是ceRNA相关的，作者旨在构建一个lncRNA相关的ceRNA网络来探索胃癌(GC)发生的分子机制，与之前乳腺癌那篇文章有一些相似，但又有其创新之处。
数据和方法 1). 375例胃癌组织和32例癌旁正常组织的mRNASeq数据以及446个GC组织和45个癌旁组织的miRNAseq与相应的临床数据数据下载自TCGA( June 13, 2018 ); Ensembl数据库用来识别注释RNAs，将没有注释信息的删除。 2). 将胃癌和正常样本的lncRNA, mRNA和miRNA表达数据分别融合成一个矩阵，删除无表达或count均值小于1的行；用R包’edgeR’识别差异RNAs( FDR < 0.01&|log2FC|≥2); 然后用R包“ggplot2”和“pheatmap”绘制差异RNAs的火山图和热图。 3). 用R包“clusterProfiler”对差异mRNAs (DEmRNAs)做GO和KEGG功能注释，将显著的前5个通路可视化。 4). ceRNA网络构建流程如图1所示，然后为了挖掘潜在的ceRNA调控轴，剔除ceRNA网络中正相关的lncRNA-miRNA对和miRNA-mRNA对,R包“ggalluvial”将其可视化。5). 54组配对的胃癌临床样本由北京医院胃肠外科提供；Human gastric epithelial cell line (GES-1)和GC cell lines (MKN-45 and HGC-27)购买自American Type Culture Collection (ATCC, Manassas)，并将其培养、转染；然后对这些样本做qRT-PCR。6). 合成含野生型或突变体miR-372结合位点的CADM2 或ADAMTS9-AS2的3’-UTR序列, 然后用ADAMTS9-AS2/CADM2 3’UTR报告荧光素酶质粒和miR-372 mimics模拟物或miR-NC共转染MKN-45细胞。转染48小时后，用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性，将萤火虫荧光素酶正常化为肾小球荧光素酶。 7). 下载完TCGA的临床数据后，用R包“survival”做生存分析和统计显著性分析。
图1
结果 1). 基于TCGA数据，总共识别出1,022 差异表达的DElncRNAs, 104 DEmiRNAs和1,632 DEmRNAs，三种差异RNAs的火山图如图2.a所示; 2). 对1,632 个DEmRNAs的GO和KEGG功能注释结果如图2.b-c，大多与癌症的发生发展相关；3). 构建的ceRNA网络由41个DElncRNAs, 9个DEmiRNAs和10个DEmRNAs组成，共115条边(图3.a)，其中ADAMTS9-AS2(lncRNA)起着重要作用(图3.b)；然后作者挑选出负调控关系对构建调控轴，包含18个lncRNAs, 4个 miRNAs和6个mRNAs(图3.c)。 4). 对DERNAs的生存分析，识别出7个lncRNAs( ADAMTS9-AS2, ARHGEF26-AS1, HOTAIR, HOTTIP, LINC00052, NKX2-1-AS1, and VCAN-AS1 )和5个mRNAs ( CADM2, COL1A1, FAM129A,
SERPINE1, and TMEM100 )与生存期显著相关；对ceRNA网中lncRNAs和mRNAs的相关性分析表明，ADAMTS9-AS2的表达与CADM2, TMEM100和 FAM129A显著相关； 5). ADAMTS9-AS2/miR-372/CADM2作为潜在调控轴被挖掘出来，ADAMTS9-AS2和CADM2在胃癌样本中都显著下调，而且它们的低表达与低生存率有关； 6).实验验证: 在54组配对的临床样本中，有44组的ADAMTS9-AS2在胃癌样本中是下调的；并且在MKN-45和HGC-27两个细胞系中也是低表达的(前者相对较高)，miR-372在敲除ADAMTS9-AS2的MKN-45细胞中表达显著增加，而在ADAMTS9-AS2过量表达的HGC-27细胞中则降低，基因CADM2的表达水平与之相反；而且miRcode和TargetScan中在ADAMTS9-AS2和CADM2的3’UTR区域预测到了miR-372的结合位点；双荧光素酶报告试验显示，miR-372模拟物显著抑制ADAMTS9-AS2-Wt的相对荧光素酶活性，而ADAMTS9-AS2-Mut未受影响，同时，野生型CADM2的3’UTR质粒的荧光素酶活性在miR-372模拟反应下显著降低，但突变的CADM2 3’ UTR荧光素酶活性也未受影响，表明这一调控轴关系确是存在的。
图2
图3
总的来说就是作者基于TCGA数据，识别出了胃癌相关的差异RNAs,然后构建了lncRNA-miRNA-mRNA网络，并重点挖掘出调控关系ADAMTS9-AS2/miR-372/CADM2，然后用多套新的数据集加以验证，证实了其可靠性。
最后，送给大家一句话: Nothing is impossible to a willing heart.
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