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近日，Nature子刊npj Precision Oncology（IF：10.092）发表了一篇文章，作者使用了三种EML4-ALK肺癌小鼠模型来测试宿主免疫在阿来替尼治疗反应中的作用。μCT连续测定肿瘤体积，流式细胞术和多谱免疫荧光法测定免疫细胞含量。通过RNA-seq评估对阿来替尼的转录反应，并通过ELISA检测分泌趋化因子。实验结果支持适应性免疫在TKI反应持久性中的作用，并证明肿瘤微环境的免疫细胞组成可预测对阿来替尼治疗的反应。
含有致癌EML4-ALK融合的肺癌对靶向酪氨酸激酶抑制剂(TKIs;例如，阿莱克替尼)，收缩程度和治疗时间(DOT)有所不同。然而，控制这种反应的因素还没有得到很好的理解。虽然免疫系统在介导免疫治疗反应中的作用已被广泛研究，但关于免疫对TKI治疗反应的作用尚不清楚。之前已经证明了TKI诱导的IFNγ转录反应与EGFR突变肺癌中的DOT呈正相关。事实上，越来越多的文献支持宿主免疫细胞在精确肿瘤药物和细胞毒性药物的整体治疗反应中的作用。然而，TKIs诱导因子介导旁分泌信号传递到免疫微环境的机制以及对整体治疗反应的贡献尚不清楚。临床前小鼠模型概括了人类疾病的关键特征，为深入的机制探索开辟了道路。
注入Adeno-Cas9-gRNA病毒在C57BL/6小鼠中诱导了多个肿瘤病灶。绝大多数病灶在阿来替尼治疗后迅速而显著地缩小。此外，TKI治疗4周后终止治疗导致部分(但不是全部)病变在4周内迅速再生，这表明存在残留疾病。因此，EML4-ALK驱动的肺癌小鼠模型和人类疾病一样表现力对治疗反应的异质性。为了进一步研究介导反应深度和持续时间变化的分子机制，开发了一组来自该模型的可移植小鼠EML4-ALK癌细胞系。
小鼠ALK+细胞系被称为EA2，还开发了另外两种EML4-ALK驱动的细胞系，EA1和EA3。从C57BL/6小鼠中分离出所有细胞系。EA2和EA3细胞系来源于TP53缺失小鼠，而EA1细胞系来源于TP53野生型小鼠。这三种细胞系对ALK TKIs、阿来替尼和lorlatinib表现出体外生长敏感性(图1a)。阿来替尼可等效地降低MAPK通路调控基因ETV4、ETV5、FOSL1和DUSP6的mRNA水平（图1b）。这表明EA1，EA2和EA3细胞在体外功能试验中对阿来替尼的敏感性相同。
用三株EML4-ALK细胞系在同基因C57BL/6小鼠左肺叶建立原位肿瘤。肿瘤形成约10~14天后，用μCT测量初始肿瘤体积，每天口服阿来替尼或灌胃稀释剂，每周测量肿瘤体积。在所有三个模型中，阿来替尼使肿瘤显著缩小(图2a)。通过μCT成像，在治疗2周后，患者的DepOR达到了最大(图3a)。EA2的DepOR最大，其次是EA3，EA1肿瘤收缩最小。3周后，停用阿来替尼，EA1和EA3荷瘤小鼠的肿瘤迅速进展，残留病变明显，而EA2荷瘤小鼠则没有(图3b)。因此，3-4周的TKI治疗可产生不同程度的残余疾病。
为了测试适应性免疫系统在阿来替尼治疗反应中的作用，将小鼠EML4-ALK细胞接种到缺乏功能性T和B细胞的nu/nu小鼠的左肺中。在所有三个EML4-ALK细胞系模型中，开始治疗后的3~4周内，肿瘤出现了显著的缩小(图2b)。EA2细胞也接种到免疫缺陷的Rag1−/−小鼠的原位位置。肿瘤短暂收缩，但肿瘤在开始治疗的3周内发生进展。这些数据表明，功能性适应性免疫细胞对于阿来替尼的持续抗癌活性至关重要。在免疫功能正常的小鼠中，EA2和EA3肿瘤的收缩程度更大，而在nu/nu宿主中繁殖的EA1肿瘤，阿来替尼诱导的收缩程度没有差异(图3c)。因此，适应性免疫有助于在阿来替尼反应的深度和持久性。
以上结果支持肿瘤微环境在介导TKI治疗反应中的作用。为了分析对照组和经阿来替尼治疗的肿瘤的免疫细胞群，采用对阿来替尼表现出部分反应的EA1模型和表现出完全反应的EA2模型。将EA1和EA2细胞植入小鼠体内，培养3周，然后用对照组或阿来替尼处理4天。采集患有EA1和EA2肿瘤的C57BL/6小鼠的左肺，并使用多光谱成像(Polaris Vectra)。在未治疗的肿瘤中，与EA1相比，EA2肿瘤中观察到肿瘤浸润CD8+细胞数量显著增加，CD3+ CD8−细胞数量相当(图4a)。阿来替尼治疗后，EA2肿瘤的CD8+T细胞含量有增加趋势，但无统计学意义；EA1肿瘤的CD8+或CD4+T细胞含量无变化。对照组EA1和EA2肿瘤的B细胞含量相似，在阿来替尼治疗后没有变化(图4a)。
为了识别髓系细胞类型的潜在变化，使用流式细胞术。EA1和EA2荷瘤小鼠肺中单核细胞(CD11b+/Ly6C+)含量无差异(图4b)。与EA1肿瘤相比，对照组EA2肿瘤的肺泡巨噬细胞(MacA：CD11c+/SigF+)和招募单核/巨噬细胞群(MacB：CD11b+/Ly6G−/SigF−)含量增加，阿来替尼治疗后，MacA细胞含量降低(图4b)。相比之下，与EA2肿瘤相比，对照组EA1肿瘤的中性粒细胞(CD11b+/Ly6G+/SigF−)含量升高，而阿来替尼诱导的中性粒细胞数量减少，接近统计学意义(图4b)。
最近的研究表明，TKI刺激的IFNγ转录反应伴随着趋化因子表达的增加。三株小鼠EML4-ALK细胞系在体外用阿来替尼或DMSO处理，并进行RNA-seq，然后使用GSEA分析。数据显示，多种炎症相关的Hallmark通路在阿来替尼处理的细胞中富集，与细胞增殖相关的Hallmark通路在阿来替尼处理的细胞中显著去富集，并进一步支持阿来替尼在三种细胞系中的等效生长抑制作用。
为了探究EML4-ALK系作为原位肿瘤繁殖时趋化因子表达的多样性，从未处理的EA1和EA2肿瘤中纯化出转基因GFP表达小鼠的癌细胞进行RNA-seq分析。如图5所示，CXCL9和CXCL10这两种具有T细胞募集功能的趋化因子在EA2肿瘤中的mRNA水平明显高于EA1。与EA1肿瘤相比，未治疗的EA2肿瘤中CCL2和CCL7的表达也更高。相比之下，与招募免疫抑制相关的CXCL1、CXCL2、CXCL12和TGF-β2、趋化因子和细胞因子在EA1肿瘤中的水平高于EA2肿瘤。
特定的趋化因子和细胞因子是组成炎症相关标志通路的基因的中心。选择多个趋化因子基因，并通过ELISA检测阿来替尼治疗对其分泌的影响。图6揭示了阿来替尼刺激分泌多种不同活性的趋化因子，作为抗肿瘤因子和促肿瘤因子。在EA2和EA3细胞中，CXCL10和CCL5对阿来替尼的反应显著，但在EA1细胞中反应弱。相比之下，阿来替尼诱导的CXCL1、CXCL5和CCL2分泌在骨髓系淋巴细胞募集中的作用在三种细胞系中相似。一般来说，在体外未处理的细胞系中检测到的趋化因子表达水平非常低，这表明来自小鼠宿主的信号被EA1和EA2细胞明显整合，以达到在体内观察到的不同水平。
为了探索宿主免疫微环境与患者ALK靶向TKI反应的相关性，从14例ALK+患者中获得了在诊断LUAD时和TKI治疗前的活检标本的H&E染色切片。所有患者接受TKI治疗。淋巴细胞和中性粒细胞（PMNs）在肿瘤和间质室中被定量。肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和PMN的代表性图像如图7a, b所示。结果值与患者的PFS进行Spearman相关性。PFS与PMN总含量及总PMN与总淋巴细胞之比呈负相关，而与间质、瘤内或总淋巴细胞含量无显著相关性(图7c)。结果表明，高PMN含量与TKI反应持续时间缩短有关。
在这篇文章中，作者使用了三种EML4-ALK肺癌小鼠模型来测试宿主免疫在阿来替尼治疗反应中的作用。细胞系(EA1，EA2，EA3)在免疫功能正常和免疫缺陷小鼠的肺中原位繁殖，并用阿来替尼处理。μCT连续测定肿瘤体积，流式细胞术和多谱免疫荧光法测定免疫细胞含量。通过RNA-seq评估对阿来替尼的转录反应，并通过ELISA检测分泌趋化因子。所有细胞系在体外和免疫能力小鼠的原位肿瘤中对阿来替尼同样敏感，表现出持久的收缩。然而，在免疫缺陷小鼠中，所有肿瘤模型在TKI治疗后迅速进展。在具有免疫功能的小鼠中，EA2肿瘤表现出完全缓解，而EA1和EA3肿瘤保留了残余疾病，并在TKI治疗终止后迅速进展。治疗前，与EA1肿瘤相比，EA2肿瘤具有更多数量的CD8+ T细胞和更少的中性粒细胞。此外，从未经治疗的肿瘤中恢复的癌细胞的RNA-seq显示，EA2肿瘤中CXCL9和10水平升高，EA1肿瘤中CXCL1和2水平升高。对ALK+肿瘤患者治疗前活检的分析显示，中性粒细胞含量与较短的进展时间有关。综上所述，这些数据支持适应性免疫在TKI反应持久性中的作用，并证明肿瘤微环境的免疫细胞组成可预测对阿来替尼治疗的反应。
