今天给大家分享一篇发表在BMC MEDICINE(IF:11.15)上的文章:
DNA methylation subtypes guiding prognostic assessment and linking to responses the DNA methyltransferase inhibitor SGI-110 in urothelial carcinoma
鉴定尿路上皮癌中具有预后分层的DNA甲基化亚型
一.研究背景
尿路上皮癌(UC)是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,包括膀胱癌和上尿路上皮癌,膀胱癌(UCB)占UC的90-95%,而上尿路上皮癌(UTUC)并不常见,占UC的5-10%。虽然基因组研究表明UTUC和UCB之间的体细胞改变发生率存在显著差异,但UTUC和UCB之间的表观遗传差异程度和临床相关性仍是未知。越来越多的证据表明DNA甲基化与UCB肿瘤进展密切相关。最初,DNA超甲基化的研究集中于潜在候选基因的CpG岛。独特的DNA甲基化模式可以区分非肌层浸润性和肌层浸润性UCB,并与临床预后相关。然而,UTUC中的DNA甲基化分析以及图谱研究仍然很少见。UTUC和UCB之间差异DNA甲基化的比较分析也比较有限,研究通常集中在选定的癌症相关基因上。已有文献报道,对于一些基因,UTUC中的启动子甲基化比UCB中的更常见和广泛。然而,在之前的研究中,对肿瘤组织和尿沉渣样本中UTUC和UCB的全基因组测序(WGS)和全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)数据进行比较后发现,两种癌症类型中都存在类似的基因组CNV和DNA甲基化改变。因此,对比两者之间的DNA甲基化谱将有助于UC诊断、预测甚至治疗的发展。
二.研究方法
在本研究中,研究者收集了上尿路上皮癌旁组织、上尿路上皮癌和膀胱癌组织共49例。通过整合全基因组甲基化和转录组数据研究了UTUC和UCB的表观基因组特征和图谱并发现上尿路上皮癌和膀胱癌的DNA甲基化图谱非常相似。进一步通过对肿瘤的DNA甲基化模块进行非负矩阵分解鉴定出两种与预后相关的DNA甲基化亚型(Methy-High和Methy-Low),以探索肿瘤的潜在风险分层。此研究还发现,DNA甲基转移酶抑制剂SGI-110通过上调多种抗肿瘤免疫通路抑制Methy-High 亚型膀胱癌细胞系的迁移和侵袭。
三.研究结果
1、UTUC和UCB的DNA甲基化谱比较
为了研究UTUC和UCB之间DNA甲基化图谱的潜在差异,研究者使用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)检测了原发性肿瘤组织的全基因组DNA甲基化谱,包括36个UTUC样本和9个UCB样本,以及4个相邻正常组织。正如预期的那样,当将两种类型的肿瘤与相邻的正常组织进行比较时,发现DNA甲基化水平在全基因组水平上降低,在启动子区域和5′UTR区域增加(图1A)。密度图进一步显示,与正常邻近组织相比,UC肿瘤组织中的DNA甲基化整体水平降低(图1B)。引人注目的是,UTUC和UCB中的DNA甲基化情况相似(图1C、D)。如图1E所示,对于一个具有代表性的基因组位点,chr1:32132880-53207909,UTUC和UCB中都证明了全局去甲基化,并且UTUC和UCB之间的DNA甲基化图谱非常相似。
2. DNA甲基化亚型分类
接下来,该工作研究了UC中是否存在不同的DNA甲基化亚型。研究者使用甲基化单倍型(methylation haplotype block,MHB)分析方法在UC肿瘤组织和正常邻近组织中鉴定了84345个组织特异性甲基化单倍型区块(MHB)。采用了非负矩阵分解算法对UC样本进行分类,使用具有最多可变甲基化单倍型负荷(MHL)的前20000个MHB(图2A)。45例UC样本分为两个亚型:Methy-C1(n=19;42.2%)和Methy-C2(n=26;57.8%)(图2B)。
3. UC甲基化亚型的临床病理相关性
为了研究UC中DNA甲基化亚型的临床相关性,对44名UC患者、TCGA队列中的411名UCB患者和日本队列中的86名UTUC患者进行了临床病理学关联分析。在发现队列中,属于Methy-High亚型的肿瘤患者的总生存期低于属于Methy-Low亚型的肿瘤患者。同样,属于Methy-High亚型的肿瘤患者的无进展生存期也较短(图2C)。此外,Methy-High亚型富集于更高的肿瘤分期(≥T3、12/25与2/19)和肌肉浸润性肿瘤(19/25与6/19)(图2D,E)。此外,对于日本队列,同样确定了两种甲基化亚型(Methy-Low(n=52)和Methy-High(n=34)),并进一步证实甲基化高亚型具有较短的疾病特异性生存率和无进展生存率(图2F)。由于研究者只确定了有限数量的UCB患者的WGSB图谱,因此整合了TCGA(n=411)的人类甲基化450(EPIC)BeadChip阵列数据。使用类似的策略,定义了UCB患者的Methy-High和Methy-Low亚型。值得注意的是,与UCB组中的Methy-Low亚型患者相比,Methy-High亚型患者的总生存期更短,肿瘤分期更高(图2G)。通过单变量Cox回归分析发现,T分期、年龄、淋巴结转移、远端转移和甲基化亚型与患者生存率显著相关。进一步的多变量Cox回归显示,甲基化亚型是一个独立的预后因素(图2H)。
4. Methy-High 的UC患者以basal相关基因表达为主,免疫和基质评分较高
为了描述定义UC甲基化亚型的基因表达谱,对9个UTUC肿瘤进行了RNA-seq测序,包括4个Methy-High亚型和5个Methy-Low亚型,以及已发表的TCGA UCB队列。首先,与Methy-Low亚型相比,在Methy-High亚型中识别出1664个上调基因和575个下调基因(图3A)。并发现在Methy-High中,免疫反应、上皮间充质转化(EMT)和多种信号通路(缺氧、糖酵解和血管生成)上调(图3B,C)。虽然样本量较小,但Methy-High肿瘤的免疫和基质评分往往高于Methy -Low肿瘤(图3D,E)。为了更好地了解每个甲基化亚型的特征,使用TCGA-UCB数据集比较了UTUC和UCB的Methy-High和Methy-Low之间的基因表达,以及涉及独特UCB亚型的一组功能途径。发现甲基高UC肿瘤的特征是“basal”标记物上调。与Methy-Low亚型相比,Methy-High亚型的basal标记物、EMT标记物和血管生成标记物也上调(图3F)。
5. Methy-High UC具有T细胞炎症和免疫抑制环境
研究者使用TIP系统地评估了每个甲基化亚型的免疫表型,发现与Methy-Low亚型UC患者相比,Methy-High亚型UC患者的肿瘤抗原呈递和免疫细胞向肿瘤的转运增强,而Methy-Low亚型UC患者的T细胞识别癌细胞的能力减弱(图4A)。在UTUC组和UCB组中,Methy-High患者的免疫细胞向肿瘤转移的得分显著较高(图4B)。然而,在UTUC和UCB组中,Methy-High患者的T细胞识别癌细胞的得分较低(图4C)。总的来说,这些结果表明Methy-High患者具有免疫抑制表型的炎症肿瘤。为了更好地评估免疫细胞和基质细胞在调节每个甲基化亚型的免疫表型中的作用,进一步通过MCPcounter估算了肿瘤浸润免疫细胞和基质细胞的丰度。并发现Methy-High亚型肿瘤浸润性T细胞、B细胞和单核细胞的数量显著高于Methy-Low(图4D,E)。成纤维细胞和内皮细胞在Methy-High组均显著高于Methy-Low UCB患者,在UTUC患者中也观察到类似的趋势(图4D,E)。进一步证实,Methy-High患者浸润性成纤维细胞和内皮细胞的比例高于Methy-Low患者(图4F)。这些结果进一步表明,免疫细胞和基质成分在形成Methy-High UC患者的免疫抑制表型时具有高度参与性。与这些免疫反应特征和基质反应一致,在Methy-High亚型中,与抗原呈递机制和细胞溶解活性以及免疫逃避标记物PD1、PD-L1、PD-L2和CTLA4相关的蛋白质表达显著增加(图4G)。此外,Methy-High亚型显示泛成纤维细胞转化生长因子b(TGFβ)反应信号(F-TBRS)基因的表达增强(图4G),这是成纤维细胞中TGFβ途径活性的指标,并与免疫治疗的耐药性有关。这些发现表明,激活的基质信号可能在Methy-High肿瘤的免疫抑制表型中发挥重要作用。进一步证实,Methy-High患者的免疫抑制评分高于Methy-Low患者(图4H)。总的来说,这些结果表明,免疫治疗和抗TGFβ治疗的结合可能会改善Methy-High患者的临床结果。
6. 用DNA甲基转移酶抑制剂(SGI-110)处理T24和UMUC-3细胞显示出治疗效果
DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTis)已成为逆转DNA高甲基化和相关基因沉默的新治疗工具。研究者使用SGI-110处理T24和UMUC-3细胞,在无药物培养基中培养细胞,分别通过伤口愈合和transwell实验评估细胞迁移和侵袭能力。发现SGI-110处理显著抑制两种细胞系中的细胞迁移(图5A,B)和侵袭能力(图5C,D)。UMUC-3细胞比T24细胞对SGI-110处理更敏感(图5)。总的来说,观察到在停止SGI-110治疗后细胞迁移和侵袭受到抑制,这可能解释了SGI-110治疗后观察到的抗肿瘤作用。
7. 整合分析确定T24和UMUC-3细胞中的SGI-110靶基因
为了确定SGI-110的潜在治疗价值,研究者评估了用SGI-110治疗T24和UMUC-3细胞后的基因表达谱,发现SGI-110治疗后上调的基因在多种抗肿瘤免疫途径中显著富集,如干扰素信号传导、细胞因子/趋化因子、抗原处理和癌-睾丸抗原(图6A)。SGI110治疗上调的许多基因是抗肿瘤干扰素反应信号的一部分或下游,包括与抗原呈递和细胞因子/趋化因子相关的基因(图6B,C),还发现SGI110处理后,两种细胞系中参与抗病毒活性的多个基因均上调(图6D,E)。这种反应被称为“病毒模拟”,因为细胞对外源性病毒感染的反应是一样的。在SGI-110处理后,从转座因子(包括SINE、LINEs和LTR)中识别出大量reads(图6F,G)。这些发现与早期文献报道一致,如LINE和SINE可能触发AZA治疗应答者的先天免疫系统激活。最后,还检测了癌-睾丸抗原的基因表达水平,这也被认为在激活免疫系统和杀死癌细胞方面发挥重要作用。事实上,研究者观察到T24和UMUC-3细胞中共享和细胞类型特异性癌-睾丸抗原上调(图6H)。总之,SGI-110上调了多种抗肿瘤免疫途径。
四、总结
综上所述,该工作显示UTUC和UCB中类似的潜在DNA甲基化图谱。为临床实践提供了路线图:DNA甲基化亚型分类可用于预测切除的UC患者的预后,并帮助确定哪些患者可能受益于基于顺铂的化疗或使顺铂耐药的癌细胞重新敏感。此外,也为SGI-110与免疫检查点疗法联合治疗UC提供了理论依据。文章一开始从DNA甲基化分子分型出发,逐步阐述各个不同亚型之间的特征,并且进行了实验验证,在每一个层面都进行了详尽分析,文章故事逻辑清晰合理,并且该研究有收集新的样本队列,所以可以到10+。