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今天小编给大家带来一篇今年七月Briefings in Bioinformatics杂志新鲜出炉的文章：Immune infiltration and clinical significance analyses of the coagulation-related genes in hepatocellular carcinoma（IF=13.994）。本篇文章基于KEGG数据库中收集的凝血途径，在肝细胞癌患者中区分了两种与凝血相关的亚型。并证明了两种凝血相关亚型在免疫特征和预后分层方面的明显差异。在TCGA队列中建立了凝血相关风险评分预后模型，用于风险分层和预后预测。还建立了一个nomogram，以便于临床使用该风险评分，并使用不同的方法验证其有效性。
原发性肝癌(PLC)是第六大常见恶性肿瘤，其中肝细胞癌是最常见的类型之一。全世界每年确诊的肝癌病例超过70万例，其中一半来自中国。恶性肿瘤患者易发生一些并发症，如静脉血栓(VTE)，门静脉血栓(PVT)都是肝细胞癌患者中最常见的并发症。凝血可以导致出血和血管壁破裂，也可以通过增加血管通透性和血浆外渗，从而导致血管外凝血。许多肝病，如肝硬变、自身免疫性肝病和肝肿瘤，都存在凝血系统紊乱。而最近的相关报道显示，凝血与肿瘤免疫微环境有关。
TME在肝细胞癌的发展中起着关键作用。肿瘤凝固体，一个由癌症驱动的有利于血栓形成或出血的分子效应网络，已经成为癌症研究的热点。凝固体可以与TME相互作用，甚至影响肿瘤免疫反应。凝血系统的激活有助于启动炎症反应，募集和激活多形核细胞和巨噬细胞。为了提高抗肿瘤免疫，抗凝剂可能是免疫检查点阻滞剂(ICB)的有效辅助治疗。直接口服抗凝剂(DOAC)利伐沙班可增强ICB对恶性黑色素瘤的疗效。
作者首先对TCGA数据中355例肝细胞癌患者的SCNA和突变频率进行可视化，约65.9%的患者发生CRG的DNA突变，CRG的DNA突变水平从2%到5%（图1A,B）。虽然CRG中没有观察到很高的突变频率，但SCNA是大多数DNA改变的原因。约66.57%的肝细胞癌患者至少有一个CRG的SCNA。大多数具有高CNA频率的CRG倾向于共扩增而不是共缺失（图1G）。此外，Kaplan-Meier生存曲线显示，CNA频率低的患者比CNA频率高的患者有更长的OS和PFS。
根据TCGA中CRGs的表达水平，采用非监督聚类，确定了两种不同的调控模式，包括凝血相关簇1中的200例患者和凝血相关簇2中的109例患者。对三个数据集(TCGA、ICGC和GSE14103)进行评估，簇1的生存优势都高于簇2（图2C）。簇1患者的组织学G1、Child1级、TNM分期I-II和存活结果的比例高于簇2，卡方检验结果显示不同临床特征之间的差异有统计学意义（图2E）。也就是说CRGs可能通过一些潜在的机制影响肿瘤的发展。
GSVA发现这两个亚型有着不同的免疫渗透模式。簇1显著富含免疫和炎症通路(包括T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、nod-like受体信号通路、toll-like受体信号通路)和肝癌干细胞信号调节通路(notch信号通路和wnt信号通路)（图3A）。GSEA分析证实两个簇在免疫途径上存在差异。簇1中高表达的DEGs显著富集在T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、Th1和Th2细胞分化以及Th17细胞分化。使用ImmuneCellAI，研究了两个集群的TME。簇1中高表达CD8、CD8、CD4、CD8、CD8、NKT、Th1等细胞，而簇2中高表达树突状细胞、诱导调节性T细胞、自然调节性T细胞、Th17、单核细胞和中性粒细胞。基于TCGA表达谱的估计算法计算恶性肿瘤组织的间质评分、免疫评分和ESTIMATE评分。
簇1样本的评估分数也显著高于簇2，基质评分和免疫评分也显著高于簇2。包括TMB评分、TEDGE评分和免疫检查点分子表达在内的一系列评价指标代表了对免疫检查点抑制剂的反应。经Wilcoxon检验，PD-1、PD-L1、CTLA4、HAVCR2、LAG3和TIGIT的表达水平簇1均显著高于簇2，TMB评分也明显高于簇2（图4）。
图5A图由200个节点和6742条边组成的CRG的PPI网络。采用度和最大邻域分量(MNC)两种拓扑算法从复杂的PPI网络中识别HUB基因。由两种方法计算的前20个基因如图5B所示。在这两种算法中，这些基因的排序序列是相同的。因此，这20个CRG可以被视为凝血途径的枢纽基因。借助GSE19151，包括深静脉血栓形成样本和正常样本，进一步筛选出关键的CRG。LIMMA识别了VTE和正常样本之间的总共740个度。来自GSE19151和前20个CRG的重叠DEG发现了三个关键的CRG(PRKACA、PIK3R1和ITGB2)（图5D）。PRKACA和ITGB2在大多数癌症的肿瘤样本中上调，PIK3R1主要在LIHC、THCA和KIRP中上调。三个关键CRG在KIRC、KIRP、LIHC和THCA中均表现出扩增的表达模式。泛癌生存分析表明，关键的CRG在多种癌症中起到保护作用（图5F）。
对TCGA数据集进行单变量COX回归。发现只有PIK3R1可作为肝癌的良好保护因子。PIK3R1与肝细胞癌中的OS显著相关。最后进行多变量Cox回归，变量包括PIK3R1、T期、N期和M期。发现PIK3R1可作为独立的预后因素（图6D）。结果再次表明，凝血途径与肝癌患者的生存密切相关，即PIK3R1可能是一个对恶性肿瘤患者具有更好预测价值的保护因子。
使用TCGA数据中有OS信息肝细胞癌患者建立预后模型。采用LASSO Cox回归分析从300个CRG中筛选出最佳预后信号。将变量引入Lasso Cox回归模型，选取11个凝血相关指标，建立凝血相关风险评分(CRRS)模型。其中一些标志物如PLCB4、GP6、PIK3R1、GP1BA和PLA2G4F的表达水平似乎无统计学意义(P>0.05)，但可能与其他标志物和预后相关。SERPINA1、PLCB3、PIK3R6和PPP1CB的表达水平与预后显著正相关，而GP6、P2RX1、PLA2G4F、PLCB4、GP1BA、PIK3R1和CFHR3的表达水平则相反（图7 C,D）。与其他单因素COX回归模型相比，组合模型具有最高的C指数。在三个不同的数据集(TCGA、ICGC和GSE14520)中，与其他单一信号相比，联合模型的ROC曲线下面积(AUC)最大，这证明联合模型的预测效率最高（图7G）。对于生存分析，根据建立的计算公式计算每个患者的CRRS，包括微阵列数据(GSE14520、GSE76427和GSE10143)和测序数据(TCGA和ICGC)。根据中位风险评分，这些病例被分为高风险和低风险队列。
比较5种免疫检查点分子(PD1、PD-L1、CTLA4、LAG3和HAVCR2)在高低危险组的表达。三种免疫检查点分子(PD-L1、CTLA4和LAG3)在高危人群中显著上调（图8A）。IPS、IPS-CTLA4、IPS-PD1和IPS-PD1-CTLA4评分在高危人群中较高（图8B）。作者比较了TMB、TME评分和TEDER评分在不同风险组中的分布。发现高危人群的TMB和TME评分较高，TIDE评分则相反（图8C,D,E）。目前，免疫治疗发展的瓶颈之一是缺乏新的预测生物标志物。根据上述研究，凝血亚型与免疫微环境有显著相关性，因此我们试图研究CRRS能否预测肝细胞癌的免疫治疗反应。
使用接受抗PD-L1治疗的尿路上皮癌数据集(IMvigor210)和接受抗PD-1和抗CTLA4治疗的恶性黑色素瘤数据集(GSE91016)作为测试集。根据IMvigor210、GSE91016和GSE140901的结果，不同凝血亚型之间的反应亚型(CR、PR、SD和PD)有显著差异。CRRS值高的患者SD/PD比例较高，CRR值低的患者CR/PR比例较高。将三个数据中接受免疫治疗的患者分为高CRRS亚型和低CRRS亚型。使用ROC分析来评估CRRS免疫治疗益处的预测潜力。ROC曲线下的面积(AUC)在IMvigor210中为0.9013，在GSE140901中为0.9444，在GSE91061中为0.9016。这些结果表明，低风险组比高风险组对免疫治疗的反应更好。这就解释了为什么低CRRS的肝细胞癌患者的存活率高于高CRRS的患者。
在GSE104580中检验CRRS在接受TACE治疗的肝癌患者中的预测价值。该数据包括TACE反应和TACE耐药的肝细胞癌患者的mRNA表达阵列。通过比较GSE104580的CRRS，发现TACE有效组的CRRS高于TACE耐药组（图9A）。ROC曲线显示CRRS对TACE耐药有较高的诊断价值。此外，在GSE69164和GSE7750中阐明了风险评分和PVTT之间的关系（图9 B,C）。有门静脉血栓形成的肝癌患者的CRRS明显高于无门静脉血栓形成的肝癌患者，ROC曲线也证明CRRS能特异性地区分有无门静脉血栓形成的肝癌患者。计算每例肝癌患者对6种常用化疗药物的IC50值。通过比较两个风险组IC50值的差异，我们发现高CRRS亚组对除罗可维汀外的大多数药物敏感（图9D）。利用药物基因相互作用数据库(DGIdb)寻找对肝癌有治疗作用的小分子药物。在PubChem中发现了阿司匹林、Alpelisib、Copanlisib、Sonolisib、PF-04691502和Pilaralisib的三维结构断层扫描（图9E）。
通过单因素和多因素的COX回归分析来确定CRRS是否是肝细胞癌患者临床独立的预后因素。将CRRS、年龄、性别、儿童分级、肿瘤类型和TNM分期作为协变量进行分析（图10 A,B）。结果表明，年龄、分期和CRRS是可用于预测肝细胞癌患者预后的独立因素。通过结合独立的预后因素，作者构建了一个nomogram，作为临床相关的量化方法，临床医生可以通过它来预测肝癌患者的死亡率（图10C）。通过将每个预后参数的打分相加，每个患者将被分配一个总打分值。总分越高，患者越差。此外，多个队列(TCGA、ICGC和GSE76427)的校准图表明，nomogram的性能与理想模型的性能相似。基于TCGA数据的不同变量的随时间变化的C指数曲线显示，与其他单一因素相比，nomogram的表现最佳。三个数据随时间变化的ROC也表明，nomogram具有很高的预测能力（图10 D,E,F）。
在这篇文章的研究中，利用无监督聚类算法，基于TCGA数据识别与凝血相关的分子亚型。比较了两种凝血亚型在富集注释、TME和免疫治疗反应方面的差异。然后，作者探索了凝血途径中的关键基因，并验证了它们对肝细胞癌患者预后的重要价值。基于LASSO Cox回归模型筛选出的7个预后指标，从TCGA队列中构建了肝癌患者凝血相关风险评分(CRRS)预后模型。在不同的平台数据集上评价其对免疫检查点抑制剂、经导管动脉化疗栓塞术(TACE)和化疗的生存概率和治疗效果的预测能力。最后，结合风险评分和其他预后临床指标，构建一个nomogram来量化生存概率。根据这些结果，可以得出结论，肝癌患者的凝血状态与TME之间存在明显的相关性，风险评分可以作为一个强有力的预后生物标志物，为化疗和免疫治疗提供治疗益处，并可能有助于肝癌患者的临床决策。
