铜死亡作为铜依赖性的新型细胞死亡方式，受到了广泛关注，是一个热点研究方向。生信人也推出了多个铜死亡有关的研究思路及文章，小编今天再和大家分享一篇今年2月刚刚发表在Frontiers in Immunology(IF：IF:8.786)杂志上研究类风湿关节炎中铜死亡相关的分子亚型及免疫谱系的文章。

Identification of copper deathassociated molecular clusters and immunological profiles in rheumatoid arthritis

类风湿关节炎中铜死亡相关的分子亚型及免疫谱的识别

一．研究背景

类风湿关节炎(RA)是一种慢性炎症性关节疾病，会破坏患者的骨骼、软骨和肌腱，在严重情况下会导致畸形和残疾，严重影响患者的生活质量。目前RA的发病机制尚不明确，不过研究已经发现线粒体稳态失衡会导致RA的发生。而铜死亡的主要机制与脂酰化线粒体酶的过度积累有关。因此，该研究基于GEO数据集对类风湿关节炎(RA)与铜死亡相关基因(CRGs)的关系进行了研究。

二．文章摘要

研究基于GEO数据对RA和非RA之间的差异基因与CRGs和免疫特征间的关联进行了详细分析。研究首先识别了CRGs相关的分子亚型，并分析了其表达和免疫浸润情况。接着通过WGCNA算法识别了CRGs亚型的特异基因。此外，研究构建了4个机器学习模型并进行外部数据及RA大鼠模型验证。最终研究确定了13个CRGs在染色体上的位置、表达模式及与免疫浸润的关联。

三．文章的主要内容及结果

1. CRGs识别和免疫分析

文章首先介绍了差异CRGs的识别及免疫分析。研究基于GSE93272数据集分析了13个CRGs在RA和非RA对照组之间的表达，结果确定了7个差异表达的CRGs。其中，LIPT1、FDX1、DLD、DBT、LIAS和ATP7A在RA中的表达水平显著高于非RA水平，而DLST在RA中的表达水平显著低于非RA水平(图1A，B)。随后，研究对12个CRGs在染色体上的位置进行了分析(图1C)。接着研究分析了差异表达CRGs之间的相关性来探索铜死亡基因在RA发生发展中的作用(图1D)。此外，研究也对RA和非RA样本进行了免疫浸润分析(图1E)，结果发现RA患者的记忆B细胞，M0巨噬细胞及M1巨噬细胞等细胞的浸润水平较高(图1F)。进一步研究对7个差异表达的CRGs进行了免疫浸润分析(图1G)，结果发现多个基因与免疫细胞浸润正相关，作者由此推测CRGs可能在调节RA免疫浸润中发挥关键作用。

2. RA的无监督聚类分析

在这一部分研究基于差异CRGs对RA进行了聚类分型。研究使用一致性聚类将232个RA样本根据7个CRGs的表达进行分组，研究发现k = 2时效果最好(图2A)，当k = 2、3、4时，CDF值逐渐增大，当k = 4时，CDF值逐渐减小(图2B-D)。最终研究将232例RA患者分为两组(CRGscluster C1和CRGscluster C2)，这两组的PCA分析表明两者之间存在显著差异(图2E)。

3. CRGscluster的表达及免疫浸润特征

在这一部分作者对识别的CRGscluster C1和CRGscluster C2的表达及免疫浸润进行了分析。研究首先分析了7个CRGs在CRGscluster C1和CRGscluster C2之间的表达差异(图3A)，结果发现CRGscluster C2中FDX1、DLD、LIPT1和LIAS显著高表达(图3B)。此外，研究还分析了CRGscluster C1和CRGscluster C2的免疫浸润(图3C)，结果观察到CRGscluster C2和CRGscluster C1中多种免疫细胞存在浸润差异(图3D)。

4. CRGscluster交集基因的一致性聚类分析

这部分研究进一步根据CRGscluster的交集基因进行聚类分析。研究根据CRGscluster C1和CRGscluster C2的交集基因进行重新聚类将RA患者分为不同的亚组，结果发现当k = 2时聚类效果最优(图4A)，当k = 4时，CDF值变小(图4B-D)，最终RA样本被分为两组:genecluster C1和genecluster C2。接着研究分析了genecluster C1和C2之间CRGs的表达差异(图4E)，结果发现genecluster C2中LIPT1、FDX1、DLD和LIAS的表达水平显著更高(图4F)。此外，研究分析了genecluster C1和C2的免疫浸润情况(图4G)，结果观察到genecluster C2中多种免疫细胞浸润水平较高(图4H)。接下来研究绘制了CRGscluster C1、C2和gencluster C1、C2的铜死亡相关评分亚型的冲积分布图(图5A)，并比较了genecluster C1和C2之间的铜死亡相关评分，结果发现genecluster C2的铜死亡相关评分显著高于C1(图5B)。此外，研究还分析了CRGscluster C1和C2之间的铜死亡相关评分，结果发现CRGscluster C2的铜死亡相关评分显著高于CRGscluster C1(图5C)。研究也比较了CRGs在CRGscluster C1和C2与genecluster C1和C2之间的表达，结果发现PDHB、PDHA1、LIPT1、FDX1、DLD、LIAS和DLAT在CRGscluster C2和genecluster C2中的表达显著高于CRGscluster C1和genecluster C1，而SLC31A1和ATP7B则不然(图5D，E)。

5. 基因模块筛选及共表达网络构建

这一部分研究对RA中的基因模块进行了筛选，并构建了共表达网络。研究首先识别了RA与非RA患者的差异表达基因(DEGs，图6A、B)，接着对这些基因进行功能富集分析(图7 A、B)，进一步使用WGCNA算法分析了与CRGscluster密切相关的关键基因模块。研究以β = 13，R2 = 0.9为标准构建了无标度网络，并识别出关键模块(图8A-D)。研究进一步分析模块与临床特征(Cluster1和Cluster2)的关联，结果发现MEturquoise模块与Cluster2的相关性最高(图8E)。MEturquoise模块与Cluster 2的基因相关性分析如图8F所示。

6. 机器学习模型的构建及评估

这一部分研究为了进一步识别具有较高诊断价值的特定基因，构建并验证了机器学习模型。研究基于MEturquoise模块中hub基因与DEGs的交集基因构建了4个机器学习模型，分别为随机森林(RF)、支持向量机(SVM)、GLM和XGB，接着使用DALEX包对上述4种模型进行比较，结果发现RF模型残差相对最低(图9A，B)。接着研究基于均方根误差(Root mean square error，RMSE)对每个模型的前10个显著基因进行排序(图9C)，并基于5倍交叉验证绘制4种模型的ROC曲线，综合评估其效能(图9D)，结果发现RF模型能够更好地区分不同的患者。RF模型最终获得5个显著基因，研究将其作为后续分析的预测基因，并构建了列线图进一步评估RF模型的预测效能(图10A)。进一步研究使用校准曲线和DCA相结合的方法对构建模型的预测效能进行评估，校准曲线显示RA聚类的实际风险与预测风险之间存在较小的误差(图10B)，DCA结果表明该列线图具有较高的准确性，可以为临床治疗决策提供一定的参考和依据(图10C)。

7. RF候选基因的评估与分析

这一部分研究对RF得到的候选基因进行了评估及分析。研究首先分析了这些基因在RA和非RA样本中的ROC曲线，并比较了它们在不同样本中的表达水平。ROC曲线结果显示基因FAM96A的诊断价值最高，且其他基因的AUC也均大于 0.750，预测效果较好(图11A-E)。此外，通过对其表达水平的分析也观察到所有基因在RA患者中的表达均显著高于非RA组(图11F-J)。

8. RA实验动物模型中qRT-PCR验证预测基因

研究在最后一部分进行了动物实验，对预测基因进行了验证。研究采用qRT-PCR检测并比较RA模型大鼠和对照大鼠踝关节组织中识别基因的表达情况(图12)，结果发现与正常对照组相比，FAM96A、MAK4P3、PRPF39、SLC35A1、TMX1 5个基因在RA大鼠模型中表达显著升高。

到这里这篇文章的主要内容就介绍完了。文章使用公共数据对RA中铜死亡基因的表达进行了分析，并研究了这些基因与RA免疫微环境的关联，也进一步根据这些基因进行了分型及预测模型的构建。研究内容丰富，但用到的方法都比较基础经典，小编觉得文章最重要的亮点在于抓住了铜死亡这一热点，对铜死亡感兴趣的小伙伴可以参考一下这篇文章的思路及内容呀。