今天和大家分享的是2022年3月1日发表在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（IF：13.751）的一篇文章。看看WGCNA作为一个成熟且好用的算法是如何在干湿结合的工作中发光发热的吧！

System analysis based on the cancer–immunity cycle identifies ZNF207 as a novel immunotherapy target for hepatocellular carcinoma

基于癌症-免疫循环的系统分析识别ZNF207为肝细胞癌的新型免疫治疗靶点

摘要

免疫检查点抑制剂作为晚期肝细胞癌 (HCC) 的单一疗法未能取得令人满意的结果，联合疗法却显示出更好的效果。识别免疫检查点抑制剂的新联合靶点迫在眉睫。作者将癌症-免疫循环评分与加权基因共表达网络和系统分析相结合，筛选出HCC中的免疫抑制靶点：锌指蛋白207（ZNF207）。作者发现缺氧诱导的ZNF207的上调促进了免疫功能正常的小鼠HCC的进展，同时与CD8+T细胞浸润减少和耗竭增加有关。实验证明MAPK–CX3CL1轴参与了ZNF207介导的CD8+T细胞趋化。此外，ZNF207转录调节吲哚胺2，3-双加氧酶1，使犬尿氨酸的水平升高。作者还发现ZNF207表达较低的患者对PD1治疗更敏感，沉默ZNF207可能有利于抗PD1联合治疗。

背景

肝细胞癌是全球癌症相关死亡的第三大原因，然而III期临床试验中，使用免疫检查点阻断剂治疗不可切除的肝细胞癌没有明显提升患者的生存效益。几项初步的大型III期试验使用抗PD1或抗PD-L1药物联合抗CTLA4或抗血管生成药物，这种疗法与索拉非尼单药疗法相比，对不可切除的肝细胞癌有更好的生存率。因此，识别新的免疫检查点和开发新的联合治疗已成为肝细胞癌免疫治疗研究的主要焦点。锌指蛋白207(ZNF207) 是人类基因组中最大的转录因子家族，其中ZNF与其他转录因子或辅助因子结合在发育、分化和代谢中发挥着不同的作用。在本篇文献中ZNF207作为与预后不良相关的因子，能够与抗PD1联合治疗肝细胞癌。

主要研究内容及结论

ZNF207 是 HCC 中潜在的免疫抑制靶点

为了寻找HCC中潜在的免疫抑制靶点，作者使用TCGA中的HCC转录组数据，以及从TIP数据库中下载的癌症-免疫循环评分进行WGCNA分析。经过聚类分析，作者一共得到20模块。对所有模块进行相关性分析，发现存在两个具有相似内部表达模式的簇（图1A）。进一步分析发现，簇1 中的模块与癌症免疫周期的步骤 1-4 呈正相关，而簇2 中的模块与步骤 5-7 呈负相关（图1B）。brown和turquoise是簇1和簇2差异最显著的模块，为了进一步探究两个模块的功能，作者将两个模块的基因进行Gene Ontology 注释分析。brown模块中的基因富集在免疫相关信号通路，这些信号通路与癌症-免疫循环的第 1-4 步呈正相关（图1C）；turquoise模块中的基因主要富集在 RNA 转运、RNA 剪接和纺锤体组装过程中，这些过程与癌症-免疫循环的第 5-7 步呈负相关（图1D）。为了识别 HCC 中的免疫抑制靶点，作者专注于turquoise模块，最后筛选出符合标准的ZNF207（图1E）。对22个临床HCC样品进行RT-qPCR检测，发现NF207与CD4、FOXP3、CD11b和CD68之间存在较强的正相关，与CD8A、C2和C3之间却存在较强的负相关（图1F-I）。综上所述，ZNF207 作为 HCC 潜在的免疫抑制靶点，可能与癌症-免疫循环的步骤相关。

ZNF207在HCC中高表达并与预后不良有关

HCC的进展通常会有基因的异常表达，作者发现肿瘤组织中ZNF207的表达高于正常样本（图2A），Oncomine和GEO数据库的数据也具有同样的趋势（图2B-C）。ZNF207的转录和翻译水平都显著升高(图2D-E)。免疫组化(IHC)分析显示，ZNF207主要在细胞核中过表达，与其作为转录因子的作用一致(图2F)。在 ZNF207高表达组中，HCC患者中stageⅢ和Ⅳ、grade3，4和T3，4所占比例更高，同时与ZNF207低表达组存在显著差异（图 2G），并且在多个数据集中表现出更短的总体生存和无病生存（图2H）。单变量和多变量COX分析显示ZNF207是独立的预后因素。总之，ZNF207在HCC患者中高表达，并且与更差的预后相关。

在HCC中缺氧会提高ZNF207表达水平

作者发现‘HYPOXIA_VIA_HIF1A_UP’特征在ZNF207high组中显着富集（图3A）。在实验中，作者观察到物理和化学模拟缺氧都可以提高ZNF207的蛋白水平（图3B-C）。BAY87-2243（缺氧诱导因子HIF1α的抑制剂）在缺氧条件下对ZNF207具有更强的抑制作用（图3D-E）。在常氧条件下，使用质粒过表达HIF1α和HIF2α，发现缺氧对ZNF207的影响可以重现（图3F-G）。在双荧光素酶报告基因实验中，缺氧和氯化钴的培养都增强了ZNF207启动子基因的荧光强度（图3H）。ChIP-qPCR检测显示，ZNF207启动子区域有六个HIF共有结合位点（图3I）。在常态和缺氧条件下，用抗HIF2α抗体免疫沉淀了位于TSS相对的-1012/-1017 bp的一个DNA序列（图3J）。总之，缺氧可通过转录调控提高HCC中ZNF207的表达。

ZNF207促进与CD8+T细胞浸润和衰竭有关的HCC

作者首先在体外功能丧失和功能获得实验中评估了ZNF207对细胞增殖的影响。无论ZNF207敲低(KD)还是ZNF20过表达（OE），HCC细胞系的细胞增殖都保持不变。此外，ZNF207-KD或ZNF207-OE不会改变免疫缺陷小鼠异种移植肿瘤的生长速度（图4A-B）。ZNF207-KD或ZNF207-OE处理 Hepa1-6细胞，发现会明显影响肿瘤的生长速度，但在体外没有显示出细胞增殖的差异（图4C-D）。在ZNF207-KD或ZNF207-OE中，腺相关病毒8显著改变了免疫功能正常的小鼠的肿瘤生长（图4E）。这些发现表明ZNF207诱导的HCC进展与肿瘤免疫有关。通过流式细胞术分析，ZNF207-KD增强CD8+ T细胞浸润并抑制其耗竭（图4F）。使用条件培养基在体外模拟ZNF207对T细胞功能的影响。从ZNF207-KD Hepa1-6细胞获得的条件培养基对自然杀伤细胞、B 细胞和巨噬细胞没有显着的趋化作用，而对CD8+ T细胞表现出显着的趋化作用（图 4G）。ZNF207与TCGA-LIHC数据集中耗尽的T细胞基因特征和免疫检查点分子呈正相关，与实验结果一致（图4J-K）。综上所述，ZNF207通过肿瘤免疫促进HCC进展，这与CD8+ T细胞的浸润和耗竭相关。

ZNF207通过MAPK-CX3CL1轴抑制CD8+ T细胞浸润

为了阐明ZNF207影响CD8+ T细胞浸润和耗竭的潜在机制，对Hepa1-6-shZNF207和Hepa1-6-shNC细胞进行了RNA测序分析。GSEA分析显示免疫和代谢相关信号通路在ZNF207-KD组中显着富集（图5A）。趋化因子、细胞因子-细胞因子受体相互作用和T细胞受体信号通路被上调（图5B）。作者通过细胞因子阵列来比较Hepa1-6-shZNF207和Hepa1-6-shNC细胞的细胞上清液和裂解物中的 111 种细胞因子，CX3CL1与T细胞趋化密切相关，而且在上清液和裂解物中具有一致的趋势（图5C），因此作者主要关注CX3CL1。作者通过ELISA证实了细胞上清液中CX3CL1的上调（图5D）。此外，在人类HCC样本中观察到ZNF207和CX3CL1之间存在强负相关（图5E）。当用CX3CL1中和剂处理时，条件培养基对 CD8+ T 细胞的趋化作用减弱（图5F）。生存分析显示，CX3CL1低ZNF207高组的患者总生存率（OS）最差，HR最高，而CX3CL1高ZNF207低组的生存结果最好（图5G）。以上研究表明，CX3CL1在ZNF207介导的CD8+T细胞浸润和HCC进展中发挥着重要作用。GSEA分析表明，MAPK信号通路在 ZNF207-KD 组中显着富集（图 5A，H）。实验证明，p38MAPK抑制剂 (SB203580) 可以直接抑制Hepa1-6细胞中的CX3CL1，并且ZNF207-KD对CX3CL1的过表达也可以被SB203580逆转（图5I-J）。通过上述的工作，作者发现ZNF207可能通过MAPK-CX3CL1轴抑制CD8+ T细胞浸润。

ZNF207通过提高犬尿氨酸水平促进CD8+T细胞衰竭

之前的结果显示除了免疫通路外还在代谢相关通路显著富集，作者假设ZNF207 可能影响肿瘤代谢以调节CD8+ T细胞功能。通过对Hepa1-6-shZNF207和 Hepa1-6-shNC细胞的代谢组学分析，作者验证了富集分析的结果；并且ZNF207-KD 后各种代谢物下调，其中氨基酸是差异代谢物的最大成分（图6A）。KEGG和GO富集分析显示，差异代谢物在色氨酸代谢通路中显着富集。ZNF207-KD 后，色氨酸代谢通路中的代谢物水平，包括犬尿氨酸的水平，被显着抑制（图6B）。正如预期的那样，ZNF207-KD 抑制了细胞上清液中的犬尿氨酸水平，ZNF207-OE呈现相反的现象（图6C）。已有研究表明，肿瘤细胞释放的犬尿氨酸可诱导 T细胞耗竭，这解释了ZNF207如何促进HCC中CD8+ T细胞耗竭的部分机制。作者将犬尿氨酸添加到 ZNF207-KD 细胞的条件培养基中以监测 CD8+ T 细胞耗竭，实验结果显示犬尿氨酸补充剂显着诱导 CD8+ T 细胞耗竭（图6D）。综上所述，犬尿氨酸参与了ZNF207介导的CD8+ T细胞耗竭。

ZNF207 转录调节 IDO1 以促进犬尿氨酸的产生

为了进一步探究ZNF207是如何改变犬尿氨酸代谢，作者关注犬尿氨酸代谢通路中的关键基因，这些基因在ZNF207-KD组中显着下调。ZNF207表达仅提高 IDO1的mRNA水平，但不提高IDO2或TDO2。基于这些发现，作者提出假设：ZNF207可以转录调节IDO1。为了验证假设，作者进行双荧光素报告基因实验，结果表明，当IDO1启动子-荧光素酶质粒与ZNF207-OE质粒共转染时，荧光强度增加（图6E）。ChIP-qPCR证实ZNF207可以结合IDO1启动子的三个区域（图6F）。用特异性抑制剂PF-06840003抑制IDO1，可逆转由ZNF207表达介导的犬尿氨酸水平（图 6G）。此外，PF-06840003治疗逆转了由来自 ZNF207-OE 细胞系的条件培养基引起的CD8+ T 细胞衰竭（图6H）。体内实验表明，PF-06840003 治疗逆转了ZNF207-OE的促肿瘤生长作用，IDO1通路在ZNF207介导的 HCC 生长中起关键作用。这篇文章初步证明了ZNF207可以通过转录调节IDO1来提高犬尿氨酸并诱导CD8+ T细胞衰竭。

ZNF207是与抗PD1疗法相结合的潜在治疗靶点

通过上述的工作发现，ZNF207可以通过调节肿瘤免疫来促进HCC的进展，在本节工作中将致力于研究ZNF207与抗PD1疗法相结合治疗HCC患者的潜力。虽然单独抗PD1治疗可以抑制肿瘤生长，但ZNF207-KD联合PD1单克隆抗体表现出突出的肿瘤抑制效果（图7A-C）。ZNF207-KD加抗PD1治疗组的PCNA阳性细胞百分比最低，而浸润性T细胞明显增加（图7D）。接下来作者采用TIDE和Submap算法来预测TCGA-LIHC数据集中不同ZNF207表达的患者的免疫治疗反应率（图7E）。ZNF207高表达组中只有21.6%的患者对免疫治疗有反应，而 ZNF207低表达组有70.3%的患者有反应（图 7F）。此外，与CTLA-4单克隆抗体相比，ZNF207低表达组患者对PD1单克隆抗体治疗的反应更好（图 7G）。综上所述，ZNF207可以作为一种生物标志物和治疗靶点，结合抗PD1疗法治疗HCC。

总结

在这个工作中先利用生物信息学方法筛选基因，然后通过生物学实验探索ZNF207在HCC中的作用，并使用公共数据进行验证，发现ZNF207作为联合治疗靶点的潜力。众多的基因中如何找到最关键的那一个，逐一用实验验证大大增加了我们实验的成本。我们可以明确实验目的，选择合适的方法，结合生物信息手段，快速锁定目标，让我们的工作少走弯路！