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本11月16日Nature杂志发表了一篇关于铁死亡的文章“Ferroptosis of tumour neutrophils causes immune suppression in cancer”（IF: 69.504）。文章主要发现肿瘤微环境中的PMN-MDSCs会发生自发性铁死亡。通过遗传学方法和药物抑制铁死亡，可消除PMN-MDSCs的抑制活性，减少肿瘤进展，并与免疫检查点阻断剂协同抑制肿瘤生长。
病理激活的中性粒细胞称为髓源性抑制细胞（PMN-MDSCs），它具有独特的转录、蛋白质组学和代谢特征，且具有免疫抑制作用。在肿瘤中与不良预后和免疫治疗抵抗相关。最近的研究显示PMN-MDSCs对铁死亡具有更高的敏感性。
有几种导致铁死亡的因素，GPX4/GSH机制在铁死亡中发挥重要作用。常用的铁死亡诱导剂分别靶向GPX4和胱氨酸-谷氨酸逆向转运体系。但是铁死亡诱导剂在体外实验中对肿瘤细胞有显著的杀伤力，在动物实验中却没有明显效果。因此铁死亡对于免疫细胞的影响依然有待发现。
对人类肿瘤和小鼠肿瘤PMN-MDSCs的全转录分析显示，铁死亡调节相关基因表达上调（图1a,b）。作者将人类PMN-MDSC RNA-seq数据表达差异最显著的8个铁死亡相关基因作为基因signature，并将其应用于先前报道的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的scRNA-seq数据集。在肿瘤PMN中发现铁死亡signature的表达高于外周血PMN，以及其他骨髓细胞和肿瘤T细胞（图1c,d）。作者从EL-4淋巴瘤、CT26结肠癌、Lewis肺癌(LLC)等可移植小鼠模型的骨髓(BM)、脾脏和肿瘤中分离出的PMN-MDSCs，以及转基因KrasG12DTrp53氧化磷脂酰乙醇胺Pdx1-cre (KPC)小鼠的原发胰腺癌中分离出的PMN-MDSCs中，对铁死亡相关基因进行了深入分析。与从骨髓和脾脏分离的PMN-MDSCs相比，肿瘤PMN-MDSCs显示出铁死亡相关基因的显著上调(图2)。
铁死亡的特征是铁死亡相关的脂质信号，包括含有花生四烯酸的氧化磷脂酰乙醇胺(AA-PEox)。作者在不同的肿瘤模型中使用质谱(MS)测量了PMN中的PEox。在肿瘤PMN-MDSCs中观察到AA-PEox的积累，但在从脾脏和BM分离的细胞中并没有观察到AA-PEox的积累(图3a)。为了评估不同组织中PMN-MDSCs对铁死亡的内在脆弱性，这些细胞被铁死亡触发因子RSL3处理。不同肿瘤模型的肿瘤PMN-MDSCs对RSL3的敏感性明显高于BM和脾脏PMN-MDSCs(图3b)。为了进一步阐明铁死亡对PMN-MDSC死亡的贡献，从EL-4 TB小鼠的脾脏和肿瘤中分离细胞，然后在凋亡抑制剂(z-VAD-FMK (zVAD))、ferroptosis (铁他汀-1)或necroptosis (坏死他汀-1)的存在下培养24小时。zVAD显著提高了脾脏PMN-MDSCs的存活率，证实了凋亡对PMN-MDSC细胞死亡的贡献，而ferroptosis或necroptosis不影响细胞存活。相比之下，肿瘤PMN-MDSCs的生存能力不仅受到zVAD的改善，而且还受到铁抑素-1的改善，这表明铁死亡有助于肿瘤PMN-MDSCs的死亡(图3c)。
为了进一步确定PMN-MDSCs在不同组织中经历的细胞死亡类型，作者对PMN-MDSCs进行了整体氧化还原脂质组学分析。没有发现从幼鼠和结核病小鼠的骨髓分离的细胞之间基于脂质的细胞死亡信号的含量有任何变化。在从肿瘤中分离的PMN-MDSCs中，与铁死亡激活相关的氧合PE是主要成分，其含量显著高于从骨髓和脾中检测到的PMN-MDSCs。肿瘤PMN-MDSCs中，与坏死性和焦性细胞死亡途径相关的脂源性信号水平没有升高。肿瘤PMN-MDSCs与骨髓和脾脏PMN-MDSCs的凋亡氧化脂质信号含量无差异(图3d)。这些数据表明，铁死亡途径是肿瘤PMN-MDSCs的一种主要的细胞死亡程序。
CD71是铁死亡的已知细胞标志物，作者证实了用RSL3治疗的BM PMN中CD71表达上调，但在凋亡或坏死诱导物处理中没有(图4c)。肿瘤PMN-MDSCs，CD71的表达显著高于其在脾中的对应物(图4d)。综上所述，这些数据表明，与骨髓和脾PMN-MDSCs相比，肿瘤PMN-MDSCs经历了铁性死亡。
作者研究了铁死亡是否赋予非免疫抑制PMN以抑制功能。用RSL3或细胞凋亡诱导剂staurosporine处理无瘤小鼠的BM PMN，然后去除药物并用于实验。发现经RSL3处理的PMN在夜间孵育后存活的数量显著减少，这表明化合物引起了预期的细胞死亡（图4e）。RSL3处理后，PMN获得了有效的抑制活性，表现为PMEL CD8+ T细胞的增殖下降，在同源肽存在时表达针对黑色素瘤gp100衍生肽的T细胞受体(图5a)。Alox12/15的缺失消除了RSL3诱导的培养中PMN-MDSC数量的减少（图4g）。RSL3处理的PMN上清液对PMEL脾脏细胞有较强的抑制作用。此活动在具有ALOX12/15缺失的PMN中消失（图5b）。
为了验证铁死亡在PMN介导的T细胞抑制中的作用，使用了铁死亡诱导剂IKE和铁死亡的药物抑制剂Liproxstatin-1。在Liproxstatin-1存在或不存在的情况下，用IKE处理BM PMN，上清液加入同源肽刺激的PMEL细胞。在40µM时，IKE对PMN活性的影响不大(图4h)，但仍抑制T细胞的增殖。这种作用被Liproxstatin-1消除（图5c）。在较高浓度(50µM)下，IKE减少了PMN的数量(图4i)，这一点被Liproxstatin-1逆转。凋亡抑制剂zVAD略微降低了IKE对中性粒细胞存活的影响，提示IKE也可能促进了PMN的凋亡。IKE引起PMN强烈诱导抑制活性，这不受zVAD的影响，但基本上可被Liproxstatin-1逆转(图5d)。接下来，从EL-4TB小鼠的肿瘤中分离出PMN-MDSCs，并用凋亡、铁死亡和坏死性死亡的抑制剂治疗这些细胞。在这些PMN-MDSCs存在下，检测抗原特异性T细胞的增殖。DMSO处理的对照PMN-MDSCs显示出强烈的抑制活性，这种抑制活性不受抑制细胞凋亡或坏死性死亡的影响，但被Liproxstatin-1所消除（图5e）。肿瘤微环境(TME)中的条件是否会导致PMN-MDSCs铁死亡介导的抑制。低氧可诱导中性粒细胞抑制活性，这种抑制作用可被铁死亡抑制作用所消除。在常氧条件下，骨髓中性粒细胞不受抑制，Liproxstatin-1对其无影响(图4j)。
为了测试铁死亡对体内PMN-MDSCs抑制功能的影响，建立了EL-4皮下肿瘤(S.C.)。在ALOX12/15flcre−和ALOX12/15flcre+小鼠中。Alox12/15flcre+小鼠的PMN-MDSCs的肿瘤上清液显著降低了抑制活性。Acsl4的缺失大大降低了肿瘤PMN-MDSCs上清液的抑制活性，但不影响EL4结核病小鼠脾PMN-MDSCs的抑制活性(图5m)。这些结果表明，铁死亡对肿瘤PMN-MDSCs的免疫抑制活性有重要作用，但对脾脏PMN-MDSCs的免疫抑制活性无影响。
为了验证铁死亡在PMN-MDSC介导的抑制中的作用，作者从头颈癌和子宫癌患者的肿瘤组织中分离出PMN-MDSC，并在Liproxstatin-1存在的情况下测试了它们对CD3/CD28激活的T细胞的抑制活性。经Liproxstatin-1治疗后，PMN-MDSC抑制活性显著降低(图5h)。此外，经IKE处理的PMN可有效抑制CD3/CD28诱导的T细胞增殖；这种作用可被Liproxstatin-1取消(图5i)。因此，在人类细胞中也观察到了铁死亡介导的PMN向PMN-MDSCs的转化。
为了评估铁死亡诱导过程中中性粒细胞的变化，对RSL3或星形孢子素处理4h的骨髓中性粒细胞进行了全转录RNA-seq分析。通过上调铁死亡相关基因的表达证实了RSL3诱导的死亡。RSL3处理的中性粒细胞有一个独特的转录图谱，其特征是参与氧化应激、泛素化和各种热休克蛋白的多个基因上调。与PMN-MDSC介导的抑制相关的Arg1和NOS2的表达没有变化，但RSL3处理PMN导致参与前列腺素E2(PGE2)生物合成的基因显著上调（图6）。
之后作者评估了Alox12/15缺失对肿瘤PMN-MDSC基因表达谱的影响，从Alox12/15flcre−和Alox12/15flcre+小鼠肿瘤中分离的PMN-MDSC进行了RNA-seq，并使用PMN-MDSC signature。GSEA分析发现，在Alox12/15敲除后，PMN-MDSCs中特异抑制的基因被逆转(图7a)。基因集富集分析表明，在PMN-MDSCs中Alox12/15的缺失导致与补体激活、中性粒细胞介导的免疫、单核细胞趋化以及抗原处理和提呈相关的基因上调(图7b,c)。因此，阻断PMN-MDSCs中铁死亡导致与经典的PMN激活相关的基因上调，表明这些细胞的极化从病理激活的PMN-MDSCs转变为经典的PMN。野生型和ALOX12/15flcre+小鼠肿瘤PMN-MDSCs的代谢组差异表达的代谢物进行的独创性途径分析(IPA)显示，PMN-MDSCs中铁死亡的阻断与蛋白质合成和信号转导途径的上调有关(图7d)。
PGE2与PMN-MDSC抑制活性直接相关。作者评估了存在铁死亡缺陷的肿瘤PMN-MDSCs产生PGE2的能力（Alox12/15 flcre+和Acsl4flcre+小鼠模型）。在这两个模型中，主要促铁基因的缺失导致肿瘤PMN-MDSCs释放的PGE2大幅减少(图8a)。在存在或不存在PGE2合成抑制剂的情况下，用RSL3或IKE处理骨髓PMN。或者，在PMN-脾脏细胞共培养中加入PGE2受体的阻断剂EP2和EP4，来阻止脾脏细胞中的PGE2信号。COX抑制剂没有改变PMN计数(图8b)，但它们显著减少了铁死亡诱导的T细胞抑制。Coxi和EP2/Ep4阻断剂都不能完全阻断铁死亡诱导的抑制作用(图8c,d)，这表明多条途径可能参与了PMN-MDSC铁性下垂介导的抑制的调节。
AA-PEOX的积聚是铁死亡的一个特征。先前证实了脂肪酸转运蛋白FATP2在PMN-MDSCs中上调。为了测试FATP2是否参与了肿瘤PMN-MDSCs中铁死亡的诱导，使用了PMN和MON靶向缺失SLc27a2(编码FATP2)的小鼠模型。在FATP2缺陷的PMN-MDSCs中，铁死亡相关基因的表达以及氧化的AA-PEox水平(图8e)显著降低。表明了FATP2参与了PMN-MDSCs中铁死亡的调节。小鼠的PMN-MDSCs中游离AA的含量没有变化，但PGE2的含量显著减少(图8f)。接着，评估了FATP2是否可以调节中性粒细胞铁性死亡的诱导。在SLc27a2flcre−和slc27a2flcre+小鼠的骨髓PMN中检测了不同的PEOX(作为铁死亡的指标)。RSL3诱导了PMN中PEox的积聚。然而，在缺乏FATP2的细胞中没有这种效应(图8g)。因此，FATP2的上调可能在中性粒细胞铁性下垂的诱导中起关键作用。
接下来，分析了氧化性磷脂对T细胞增殖的作用，氧化磷脂是铁死亡的主要产物。作者使用了四种合成的磷脂和它们的氧化对应物。氧化型PE和PC在5µM浓度下对小鼠T细胞增殖有明显的抑制作用，而非氧化型PE和PC则无此作用，氧化的PE在较高浓度(10µM)时导致T细胞增殖显著减少(图8h)。从RSL3处理的小鼠骨髓PMN中提取的脂类可显著抑制T细胞的增殖(图8i)。这些结果表明，铁死亡诱导的氧化脂质在T细胞抑制中起直接作用。
在PMN-MDSCs中，髓过氧化物酶(MPO)在脂质氧化中起关键作用。我们发现，与Mpo-KO小鼠肿瘤PMN-MDSCs中检测到的相比，从LLC WT小鼠分离的肿瘤PMN-MDSCs中检测到的PE和含AA以及含氧AA的溶血磷脂酰乙胺的含量显著更高(图9c)。并且作者证明它们的形成被liproxstatin-1抑制(图9d)。这些结果表明，在PMN-MDSCs中不仅存在游离PGE2，还存在其酯化成PE和溶血磷脂酰乙醇胺的形式。这些数据支持铁死亡介导的免疫抑制与细胞死亡不同的概念，可以在细胞死于铁死亡之前观察到。
接下来，研究了PMN-MDSCs的铁死亡可能会影响TME中其他细胞的功能活动，特别是肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)。在两种小鼠模型中（MPO缺失的小鼠和ALOX12/15flcre+小鼠），铁死亡抑制仅限于PMN-MDSCs。在EL-4肿瘤中，在两种小鼠模型中抑制PMN-MDSCs中的铁死亡导致TAMS中FALIS和PGE2的显著下降(图10d,e)。在MPO缺失和ALOX12/15flcre+小鼠中，TAMS的抑制活性显著降低(图10f)。这些结果提示，PMN-MDSCs的铁性死亡可能影响TAMS的铁性下垂的诱导和抑制活性。
为了确定药物抑制铁死亡对肿瘤生长的影响，作者在sc植入的EL-4和LLC TB小鼠中使用了耐受剂量的liproxstatin-1。liproxstatin-1对肿瘤的生长没有显著影响。然而，在这两种肿瘤模型中，liproxstatin -1治疗消除了肿瘤PMN-MDSCs的抑制活性。这与这些细胞产生的PGE2显著减少有关（图11a-c）。为了评估liproxstatin-1的治疗潜力，在小鼠的肿瘤的较早时间开始治疗，并持续14天。在这两个模型中，抑制铁死亡可显著降低肿瘤生长(图12a)。
在免疫缺陷的Rag2−/−Il2rg−/−双敲除CT26 TB小鼠中，liproxstatin-1的治疗效果被消除(图12b)，表明该治疗具有强烈的免疫系统依赖性。在接受Liproxstatin-1治疗的CT26肿瘤中，PMN-MDSCs和T细胞的数量高于对照组(图11d)。在这些肿瘤模型中，Liproxstatin-1增强了PD-1抗体免疫检查点阻断的抗肿瘤作用(图12c)。
为了进一步研究铁死亡对肿瘤生长的影响，作者在免疫活性结核小鼠中诱导了铁死亡。IKE治疗略微增加了CT26肿瘤的生长(图12d)。这表明，在免疫活性宿主中，诱导铁死亡并不能阻止肿瘤的生长。在另一组实验中，CT26结核病小鼠接受了带有和不带有IKE的PD-1抗体(图12d)。即使同时服用抗PD-1抗体，IKE也促进了肿瘤的生长。
为了更好地了解铁死亡抑制在PD-1反应中的作用，使用KPC小鼠晚期原发肿瘤的PD-1抗性胰腺肿瘤细胞克隆。铁死亡抑制与抗PD-1有协同作用，可使50%的移植胰腺肿瘤消退(P=0.0325)。在10只小鼠中只有1只观察到快速进展(>200%的体积变化)，而在10只对照组小鼠中有8只观察到快速进展(P=0.006)(图12e)。这些结果表明，即使在免疫治疗耐药的肿瘤中，Liproxstatin-1也可以增强PD1抗体的作用。
在淋巴结中，Liproxstatin-1治疗增加了CD8+T细胞的比例以及Ki67+CD8+T细胞的增殖(图13c)。效应性记忆T细胞显著增加，naïve T细胞、中央记忆T细胞和调节性T细胞比例下降。在肿瘤中，Liproxstatin-1治疗导致驻留记忆、中央记忆和效应CD8+T细胞以及自然杀伤细胞显著增加(图13d)。为了更好地表征肿瘤中的T细胞，用Liproxstatin-1治疗CT26肿瘤小鼠，并进行scRNA-seq。在用Liproxstatin-1治疗的小鼠肿瘤中，T细胞激活（图14）。综上所述，这些数据表明，铁死亡抑制剂治疗的肿瘤的TME中有一个活跃的T细胞群。
之后作者评估了铁死亡基因signature与临床结果的相关性。用RSL3治疗健康捐献者的外周血中性粒细胞，导致这些基因显著上调(图15a)，证实了它们与铁死亡有关。RSL3还诱导PGE2的产量大幅增加(图15b)。从非小细胞肺癌肿瘤分离的PMN-MDSCs的PGE2产量明显高于外周血PMN-MDSCs(图15c)。
接着作者使用TCGA胰腺癌数据集和一套独立的肺癌数据分析了外周血PMN-MDSCs中铁死亡signature与PMN-MDSC基因signature的相关性。虽然PMN-MDSC signature与铁死亡signature没有重叠的基因，但PMN-MDSC与铁死亡signature呈正相关(图12f，h)，并在铁死亡基因表达较低的患者组提高了存活率(图12g)。铁死亡signature与较差的存活率有关(图12i)。在接受免疫治疗的患者中，发现铁死亡与患者存活率之间存在更强的反向关联(图12i)。
本文作者发现肿瘤微环境中的PMN-MDSCs会发生因铁死亡，这使得它们更具免疫抑制作用。虽然减少了PMN-MDSCs的存在，但铁死亡诱导含氧脂质的释放，并限制了人和小鼠T细胞的活性。有几个因素使肿瘤PMN-MDSCs对铁死亡的诱导特别敏感。其中一个因素是低氧介导的肿瘤PMN-MDSCs中GPX4的下调，促进PEox的积累以驱动铁死亡。还确定了AA转运体FATP2在肿瘤PMN-MDSCs中铁死亡的调节作用。肿瘤PMN-MDSC倾向于通过FATP2转运AA，这可能是PMN-MDSC对铁死亡的敏感性高于TME中其他髓系细胞类型的原因。在具有免疫能力的小鼠中，对铁死亡的遗传学和药物抑制可以取消PMN-MDSCs的抑制活性，减缓肿瘤的进展，并与免疫检查点阻断协同作用以抑制肿瘤的生长。相比之下，在免疫能力强的小鼠中诱导铁死亡会促进肿瘤的生长。因此，铁死亡是PMN-MDSCs在肿瘤微环境中的一种独特的、有针对性的免疫抑制机制，可以通过药物调节来限制肿瘤的进展。
