大家好呀，今天分享的文章题为scRNA-seq测序分析放射化疗诱导的宫颈癌先天免疫激活和MHC-II上调，于今年一月发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》（IF = 38.104）上，文章逻辑清晰，让我们一起学习一下吧！

一、摘要

放化疗（Radiochemotherapy，RCT）是宫颈癌（Cervical cancer，CC）的一种强有力的治疗方法，它不仅影响恶性细胞，而且影响肿瘤的免疫和间质室。了解RCT诱导的局部生态系统重构将为改善宫颈癌的治疗策略提供有价值的见解。在本研究中，作者将scRNA-seq应用于宫颈癌患者和邻近正常宫颈组织的RCT前后肿瘤活检样本中，发现RCT后残留的上皮细胞群显示MHC-II类基因表达上调。此外，RCT导致了具有增加促炎特征的单核细胞髓系来源的抑制细胞（M-MDSCs）和具有更高细胞毒性基因表达特征的CD16⁺ NK细胞的积累，然而在RCT后，T细胞亚群的细胞毒性特征的表达没有显著增加。这些结果揭示了肿瘤生态系统对RCT的复杂反应，为宫颈癌中先天免疫的激活和MHC-II的上调提供了证据。

二、结果

1、利用单细胞转录组鉴定RCT期间CC动态变化

本研究在RCT治疗前后对5例CC患者的10对肿瘤组织样本进行取样，又从两个患者的邻近正常组织样本进行scRNA-seq检测。此外，作者的目标是对2个验证队列进行验证测试：验证队列1：15对用于免疫组化（immunohistochemistry，IHC）进行RCT前和RCT后的CC样本，验证队列2：20对RCT前和RCT后的CC样本的bulk RNA-seq数据。经过数据质量控制得到60550个细胞进行后续分析，手动注释成9个细胞簇：髓系细胞、T 细胞、浆细胞、B细胞、树突状细胞、血管成纤维细胞、基质成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞。作者对接受RCT治疗前后做成对比较，与预期的一样，所有患者中上皮细胞的相对频率均显著降低，这与治疗诱导的癌细胞坏死和凋亡相一致。此外，所有患者RCT后髓系细胞比例均显著升高，表明髓系细胞募集并浸润肿瘤，其它7簇细胞前后无显著差异。（图1）

2、上皮细胞亚型之间存在不同的RCT敏感性和免疫原性

本文将上皮细胞又重新分成了五个细胞簇，命名为Epi1-5。通过对这些簇差异表达基因的分析发现：间充质细胞相关基因在Epi1中表达最多；免疫相关基因LCN2和DEFB1在Epi2中表达最多；而细胞周期基因TOP2A和MKI67在Epi5中表达最多；利用GSVA分析验证了：(a) Epi1特征为WNT/β-连环蛋白和上皮-间充质转化；(b)补体和炎症信号是Epi2的标志；(c) DNA修复和高S/G2M比值是Epi5的标志。RCT改变了5个亚群的相对比例，最明显的是Epi2比例的增加和Epi3比例的减少。（图1F-G）

本文通过对免疫相关的差异基因进行GO分析来研究RCT治疗如何影响上皮细胞亚群的免疫应答相关特征，结果强调了RCT的整体免疫原性增强作用，具体而言，参与抗原呈递和处理的基因，包括MHC-II，在整个上皮细胞和Epi1/ 4/5中显著上调，而在Epi2/3中表达水平相对稳定，只有Epi2显示MHC-I表达部分下调。来自验证队列1的样本的IHC染色证实了RCT后上皮细胞中MHC-II基因的上调。证明了RCT在上皮细胞中诱导了广泛的免疫相关反应。那么RCT是如何影响上皮细胞亚群恶性特征的呢？评估发现RCT下调了与恶性CC特征相关的基因；在细胞周期方面，观察到RCT前样本中G2/S期基因的表达比例高于正常和RCT后样本；评估了RCT诱导的每个上皮细胞亚群中肿瘤细胞数量的变化，并观察到总体上的减少。值得注意的是，虽然在5个集群中的3个集群( Epi1/4/5)肿瘤细胞的比例下降到零，但在RCT后3周检测到Epi2/3中仍存在大量的肿瘤细胞。虽然残留的Epi2/3簇在那个时间点没有增殖，但Epi2表达了相对较高水平的癌前和转移前的标记基因。综上所述，RCT诱导了上皮细胞中与免疫反应相关的基因表达的增加，特别是MHC-II。与此同时，仍有一个残留的上皮细胞亚群，其特征是潜在的恶性标志和参与抗原呈递的基因低表达。（图2）

3、RCT诱导髓系细胞中促炎基因的表达

本文又将髓系细胞簇重新分成了7个细胞亚群，注释成巨噬细胞，单核细胞髓系来源的抑制细胞（M-MDSCs）和树突状细胞。不同的细胞簇表现出不同的潜能，髓系细胞群可能同时包含促肿瘤和抗肿瘤亚型。为了进一步研究这一现象，作者研究促炎性M1和抗炎性M2相关的基因在巨噬细胞簇中的表达情况，发现在巨噬细胞簇中表现出M1和M2的混合特征。在RCT后，FCN1_M-MDSC的相对比例显著增加，而CD1C_DC的相对比例显著下降。通过对来自验证队列1的样本进行IHC和来自验证队列2的bulk RNA-seq数据的RCT前后比较，发现在治疗后FCN1_M-MDSC显著增加。无论每个聚类的比例如何，RCT后所有聚类的促炎信号均升高，RCT显著上调了参与趋化、抗原加工和呈递的基因的表达；通过GO分析发现，RCT后M-MDSCs、巨噬细胞和树突状细胞中参与白细胞迁移和激活的基因表达增加。综上所述，RCT通过诱导髓系细胞促炎基因表达，促进FCN1_M-MDSCs的积累和上调（FCN1m-MDSCs具有上调的促炎性和下调的抗炎性），从而改变CC肿瘤的免疫平衡。（图3）

4、RCT对淋巴细胞室影响严重

在淋巴细胞中，NK和T细胞以其潜在的亲肿瘤或抗肿瘤作用而闻名，本文识别到10个T细胞簇和2个NK细胞簇。RCT后CD16_NK细胞比例明显增加，而CD56_NK细胞比例保持不变。使用GO分析NK细胞前和后的DEGs，发现RCT后NK亚群中与白细胞迁移相关的基因表达增加，CD16_NK细胞亚群中与细胞毒性相关的基因表达增加。CD16_NK细胞在RCT后显示GZMB、GZMH和NKG7的表达增加，这些基因的蛋白产物在NK细胞的细胞毒性颗粒中表达，大多数患者这些细胞毒性基因表达增加，联合bulk数据发现细胞毒性基因的表达与患者的生存率呈正相关。在RCT后，CD4_naive细胞的比例显著增加，而Exhausted_CD8_T细胞的比例显著下降。抑制特征在所有T细胞亚簇中都被下调，但没有发现细胞毒性评分的显著增加。（图4）

5、肿瘤相关成纤维细胞在RCT后表现出促瘤特征减少

成纤维细胞在肿瘤发生发展扮演重要角色，本文将成纤维细胞重新划分成六个亚群：基质癌相关成纤维细胞（mCAFs）、炎症CAFs（iCAFs）、抗原提呈CAFs（apCAFs）、血管CAFs（vCAFs）。GO分析结果显示： mCAFs富集在细胞外基质组织和转化生长因子反应，iCAFs富集在细胞趋化性，apCAF1富集在氧化应激反应，apCAF2富集在表皮发育，vCAF1富集在动脉发展，和vCAF2富集在细胞外基质组织和细胞基质粘附。由于CAFs介导了癌细胞对治疗的反应，作者比较了RCT前后CAF亚群的特征。发现ipCAF2中iCAFs和apCAFs的相对比例显著降低，而RCT中vCAF1的比例显著增加。通过评估CAF亚群中特征基因集的表达，发现RCT后CAFs的血管生成特征减少，炎症评分增加。

RCT治疗后，几乎所有的vCAF和apCAF亚群低表达基因集和血管生成相关，高表达基因集和炎症相关。在RCT治疗过程中，TNF和JAK/STAT通路表达上调，血管生成通路表达下调。血管生成和免疫抑制过程都促进肿瘤生长，这些数据表明RCT可能损害CAF群体的肿瘤促进能力。（图5）

6、内皮细胞在RCT中显示血管生成、缺氧和炎症基因表达增强

血管内皮细胞对深刻影响肿瘤生长及其治疗反应的因素做出反应，并产生它们。本文鉴定了5个具有不同转录特征的内皮细胞亚群（ECs）。GO term分析显示，EC1富集IFN-gamma通路和抗原加工和提呈，EC2富集上皮细胞迁移，EC3富集细胞-底物粘附，EC4富集DNA损伤检查点，EC5富集白细胞趋化性。RCT期间EC2细胞比例明显下降，但是RCT后EC2-4仍占所有EC的一半以上。事实上，与促血管生成CAF亚簇的存在相一致，RCT中与EC发育、血管重塑和缺氧相关的基因被富集，特别是EC2-4。值得注意的是，除了增强血管生成外，上皮细胞中参与上皮细胞增殖的基因的表达也显著上调。此外，在RCT后，发现在上皮细胞中参与缺氧和血管生成以及炎症的基因的富集，包括TNF/NF-kappa B和白细胞介素相关通路。这些基因与淋巴细胞和髓系细胞的抗肿瘤特征，以及TNF和白细胞介素激活ECs有关。EC的血管生成和促免疫特征使RCT对EC人群影响的解释复杂化。（图6）

7、细胞亚簇和细胞-细胞相互作用的临床意义

为了研究细胞亚群的临床意义，根据本文的单细胞数据，利用CIBERSORTx算法对TCGA数据进行反卷积评估细胞占比。发现vCAF2、Exhausted_CD8_T、EC2与CC患者的不良预后显著相关，而GZMK_CD8_T与良好预后显著相关。利用细胞配受体表达情况，研究RCT前后细胞互作网络。RCT后，M-MDSCs、NK细胞和CAFs有更多的进入相互作用，而上皮细胞、T细胞和树突状细胞的相互作用较少。在外向相互作用方面，MMDSCs、NK细胞和巨噬细胞在RCT后的相互作用较少，而上皮细胞和CAFs的相互作用更多。为了研究免疫细胞是如何被招募的，观察了RCT前后细胞簇之间趋化因子的配体-受体相互作用。与RCT前相比，RCT后上皮细胞与M-MDSCs（主要通过CCL2-CCR1/CCR2）相互作用更多，CAFs与M-MDSCs（主要通过CCL11-CCR2和CCL13- CCR1/CCR2）相互作用更多。对于NK细胞，RCT后发现CCL5-CCR1的相互作用更强。综上所述，RCT影响了细胞簇之间的相互作用，这可能促进免疫细胞渗入TME。（图7）

三、小结

这篇文章对比了RCT前后细胞比例和基因表达情况，发现：FCN1_M-MDSC的相对比例显著增加，而CD1C_DC的相对比例显著下降；CD16_NK细胞亚群中与细胞毒性相关的基因表达增加，在T细胞中并没有发现这种状况；成纤维细胞中发现RCT后CAFs的血管生成特征减少，炎症评分增加；内皮细胞在RCT中显示血管生成、缺氧和炎症基因表达增强；并通过细胞配受体发现这些细胞是通过哪些趋化因子互作进行招募的。文章逻辑清晰，清晰地对比了RCT治疗前后细胞、基因和相关通路活性的改变，对疾病进行治疗前后的单细胞测序分析也是非常值得我们学习和借鉴的。