哈喽,大家好,今天向大家分享的是近期发表在International Journal of Biological Sciences(IF:10.75)杂志上,纵观全文,作者通过筛选基底膜(BM)相关的基因,并构建了预后模型,无论在训练集还是验证集都得到了很好地结果,并通过实验验证了高基底膜基因评分(BMscore)可以促进肿瘤迁移。
Novel Implication of the Basement Membrane for Breast Cancer Outcome and Immune Infiltration
摘要
乳腺癌患者的治疗失败在很大程度上归因于术后进展和治疗抵抗。然而,一个有效的预后签名识别这一人群是缺乏的。基底膜(BM)已被证实与癌症的进展和转移密切相关,并有可能成为乳腺癌强有力的预测因子。本研究从TCGA-BRCA、METABRIC和GSE96058转录组学、单细胞RNA转录组学和临床信息,并进行Kaplan-Meier生存曲线、单细胞分析和体外实验验证模型标签基因。
数据集:TCGA-BRCA训练集和METABRIC、GSE96058两个验证集
关键词:PFS:无进展生存期;DFS:无病生存期;DSS:疾病特异性生存期
1.基因的选择和BMscore的构建
将BM基因和三个数据集基因取交集得到203个BM基因(图1A),对这些基因进行差异表达分析,在TCGA-BRCA 中77个差异表达(图1B-C)。同时,筛选了体细胞突变最多的前20个BM基因(图1D)。然后通过单变量分析筛选和OS最相关的12个BM基因用于后续分析(图1E)。通过LASSO Cox回归分析鉴定出6个关键的BM基因,包括LOXL1、FBLN1、FBLN5、SDC1、ADAMTS8和PXDNL(图1F-G)。分别研究了这6个关键基因在TCGA-BCRA中的相关性、表达和预后,总结了6个BM基因的染色体位置和表达水平,交互作用网络和相关性(图1H-I)。
基于TCGA-BRCA数据集,发现和正常对照相比,乳腺癌中LOXL1、SDC1和PXDNL高表达,而FBLN1、FBLN5和ADAMTS8低表达,并通过RT-qPCR进一步验证了6个BM基因的表达情况(图2A-B)。每个基因在不同的乳腺癌分子亚型中表现出不同的表达水平。(乳腺癌分子亚型购自ATCC并按照相应规则培养)
TCGA-BRCA中的KM曲线显示,PXDNL和SDC1高表达,BLN1、FBLN5、LOXL1和ADAMTS8低表达的患者生存更差。根据lasso的结果构建BMscore公式:BMscore=SDC1的表达* 0.1625 + PXDNL的表达* 0.0942 - ADAMTS8的表达* 0.1399 - LOXL1的表达* 0.1176 - FBLN5的表达* 0.0328 - FBLN1的表达* 0.0189。
2.BMscore预测乳腺癌预后的有效性
为了验证BMscore预测预后的有效性,作者分别将训练集和测试集分成高低BMscore两组(图3A)。所有队列中,高BMscore对应低的生存时间(图3B-C),KM曲线显示BMscore越高患者OS概率越低(图3D)。因为BM可能参与了肿瘤的侵袭和转移,作者还对TCGA-BRCA的DFS、DSS和PFS进行了KM生存分析结果显现,BMscore高的乳腺癌患者的死亡率显著增加,这意味着更不利的DFS(图3E-F)。
3.全面研究BMscore指标相关的基因
BMscore和乳腺癌生存相关,作者又分析了BMscore和临床指标之间的相关性。对于这些临床病理参数,在TCGA-BRCA中,BMscore与T stage、等级和分子亚型显著相关;METABRIC队列中,BMscore与阳性节点、等级和分子亚型显著相关;GSE96058中,BMscore与阳性节点、肿瘤大小和分子亚型显著相关(图4A-D)。结果显示,BMscore和临床指标显著相关,BMscore高的患者更容易出现淋巴结转移和严重的临床分期。
疗效对于乳腺癌的研究有着重要作用,作者研究了疗效和BMscore之间的关系,在TCGA-BRCA队列中,发现除了放疗外,高BMscore和化疗和内分泌疗法治疗后较差生存相关(图5A-C)。在METABRIC队列中发现高BMscore的患者三种治疗后预后更差(图5D-F)。上述结果有效证明BMscore可以有效地预测乳腺癌患者的耐药性。
4. 乳腺癌BMscore独立预后价值的鉴定与评估
以上的结果证明了BMscore可以有效预测预后,作者又从多个角度进行了评估,除BMscore外,同时纳入多个危险因素(年龄、T分期、N分期、M分期、PAM50亚型),对TCGA-BRCA患者OS进行单因素和多因素Cox分析。单因素分析确定BMscore、分期、年龄、N期和M期为OS的独立危险因素(图6A),在多因素分析中,年龄和BMscore仍然是OS的独立预测因素(图6B)。结合年龄和BMscore构建箱线图和DCA曲线用来预测OS (图6C-E)。ROC曲线显示了预测结果具有较高的准确性,特别是列线图在三个队列中预测效果都很准确(图6F)。列线图在预测TCGA-BRCA患者的生存预后方面具有良好的敏感性和特异性(图6G-I)。这些结果都证明BMscore可以作为一个独立的乳腺癌预后指标。
5. BMscore对乳腺癌免疫微环境的影响
肿瘤微环境在乳腺癌中起着关键作用,利用ESTIMATE评估评估肿瘤基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分,并分析BMscore和三者之间的关系,发现BMscore越高基质评分越高(图7A)。BM和免疫细胞都是肿瘤微环境中重要的组成部分,作者又使用CIBERSORT算法推断了三个队列中高低BMscore的免疫浸润情况,发现在TCGA-BRCA BMscore高组中,M0巨噬细胞、M2巨噬细胞和静息NK细胞显著增加,而naive B细胞、静息树突状细胞、静息肥大细胞、单核细胞、活化NK细胞、静息的CD4+记忆T细胞和CD8+ T细胞浸润显著增加(图7B)。同时,还分析了BMscore与免疫检查点和细胞因子表达的相关性,显示BMscore高和免疫检查点分子CTLA4、IDO1、ICOS和PVR高表达正相关(图7C)。以上提示,BMscore高的患者可能对免疫检查点阻断治疗,尤其是抗CTLA4治疗更为敏感。在细胞因子方面, TNF、IL27和IL1B在高BMscore中高表达,而IL33和IL6相反(图7D)。
作者又在单细胞数据中进行了分析,发现和其他细胞类型相比,BMscore在癌症上皮细胞、肿瘤相关的成纤维细胞(CAFs)和浆母细胞中显著差异(图8A)。有利用桑基图画出乳腺癌亚型、患者和细胞占比的对应关系(图8B)。发现不同细胞类型BMscore不同,但是癌症细胞中BMscore更高(图8C),并发现6个模型基因的表达情况与上述研究一致(图8D)。由于CAF的BMscore差异显著,进一步将CAF细胞进行分类,发现BMscore高的细胞大多被注释为myCAF-like细胞,这种细胞最集中在乳腺肿瘤的侵袭性部位(图8E)。为了研究上皮细胞异质性和BMscore、模型基因之间的相关性,将肿瘤上皮细胞分为高循环组和低循环组,并显示各组BMscore的分布和模型基因的表达(图8F-G)。
6. BMscore与EMT活性呈正相关
BM缺失是导致恶性肿瘤的重要步骤,作者又研究了BMscore与EMT之间的相关性,功能富集结果显示,高BMscore组富集的标志性通路包括根尖连接、凝血、上皮-间质转化、糖酵解和mTORC1信号通路(图9A)。高BMscore组显著富集GO term包括表皮细胞分化、表皮发育、细胞外基质结构成分、角化细胞分化和皮肤发育(图9B)。高BMscore显著富集的KEGG通路包括谷氨酸突触、IL - 17信号通路、血小板活化、脂肪细胞脂解调节和金黄色葡萄球菌感染 (图9C)。这些结果显示BM在乳腺癌进展和转移发挥作用。分析BMscore与EMT之间的相关性发现,EMT途径与FBLN1、FBLN5、LOXL1、SDC1的表达存在很强的正相关(图9D)。
结合功能注释结果,作者假设BMscore与EMT正相关,为了验证这一猜想,观察了10个乳腺癌患者中6个模型基因的mRNA表达情况(图10A)。计算这10个样本的BMscore,并选择最高和最低BMscore各三个样本进行免疫组化染色,查看Ki-76的表达情况和EMT标记基因的表达情况(图10B)。发现这些蛋白质在高BMscore的组织中相对更丰富,这揭示了BMscore和EMT活性之间的强烈正相关关系,BMscore高的乳腺癌患者可能有更大的EMT介导的转移风险。
7. SDC1在BMscore中起关键作用,同时也是乳腺癌的肿瘤启动子
综合以上结果,确定SDC1为与BMscore签名相关的关键基因,并进行了体外实验。siRNA介导的敲除,MDA-MB-231和MCF-7细胞中SDC1 mRNA水平降低(图11A)。CCK8细胞增殖试验显示,SDC1减少的MDA-MB-231和MCF-7细胞株的生长均受到显著抑制(图11B)。从划痕创面愈合(图11C)和Transwell迁移试验(图11D)可以发现,降低SDC1诱导乳腺癌细胞的迁移抑制。此外,在siRNA转染的细胞中检测EMT标记物的蛋白水平,以验证SDC1的改变是否导致了EMT标记基因的改变。如预期的那样,SDC1沉默抑制了snail、slug、N-cadherin和ZEB1的蛋白表达,而E-cadherin相应增加(图11E)。
小结
本文逻辑清晰,生信分析入手最后用湿实验验证模型基因。本文对乳腺癌的研究,从BM相关基因出发,构建BMscore预测乳腺癌患者的生存。从多个角度验证了高低BMscore患者的异质性,从免疫浸润、临床指标、肿瘤分期等等,又分析了BMscore和EMT之间的相关性,BMscore可以有效的预测肿瘤的转移。本篇文章从模型基因的筛选以及模型构建和评估,在训练集和验证集都得到了很好的结果。首先BM相关基因的筛选是从训练集合验证集交叠基因取得,所以在后续进行验证时不会出现模型基因在验证基因没有表达的情况。作者在设计试验和分析方法上都是值得我们学习的!