组织及单细胞测序相结合的研究思路在肿瘤研究中越来越受到关注，那么其在非肿瘤疾病中如何应用呢？小编今天就给大家分享一篇今年2月发表在BMC BIOLOGY（IF:7.364）杂志上结合组织及单细胞数据研究动脉粥样硬化免疫微环境并识别治疗靶点的文章。

Bulk and single-cell characterisation of the immune heterogeneity of atherosclerosis identifes novel targets for immunotherapy

基于动脉粥样硬化免疫异质性的组织和单细胞特征识别免疫治疗新靶点

一．研究背景

动脉粥样硬化(Atherosclerosis)是由内膜下含胆固醇的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)颗粒累积形成含有脂质、结缔组织和免疫细胞的斑块引起的慢性炎症性疾病，也是导致心血管疾病的主要原因。研究已经发现免疫细胞浸润病变对动脉粥样硬化进展至关重要，也是影响免疫治疗的主要原因。因此该文章通过整合多个样本的组织及单细胞测序数据，研究动脉粥样硬化的免疫异质性并识别了新的治疗靶点。

二．文章摘要

研究从公共数据库获取了动脉粥样硬化病变的组织及单细胞测序数据，首先根据单细胞表达数据识别出28个细胞亚群，接着发现这些细胞在组织偏好、遗传扰动、免疫动力学、转录调控因子、代谢变化和通信模式等水平上具有高度异质性。其中，干扰素诱导的CD8⁺T细胞参与了动脉粥样硬化的进程，而促炎CD4⁺ CD28^null T细胞则与动脉粥样硬化的不良结局有关。进一步研究也识别了两个具有不同表型的泡沫巨噬细胞亚群。此外，研究通过组织数据的去卷积分析发现破裂和出血病变中功能失调细胞的比例更高，且与动脉粥样硬化不良预后显著相关。

三．文章的主要内容及结果

1. 整合scRNA - seq数据识别动脉粥样硬化病变中主要的细胞亚群

文章第一部分整合单细胞数据分析了人类动脉粥样硬化病变中的细胞多样性。研究纳入了三个来自公共数据库的scRNA-seq数据集(图1a)，整合质控后保留了44120个免疫细胞，接着根据标志基因，将这些细胞聚类注释为T细胞、髓系细胞、B细胞、固有淋巴样细胞(ILCs)、肥大细胞和浆细胞(图1b, c)。研究发现B细胞和肥大细胞纯度较高，而髓系细胞和浆细胞的异质性更强(图1d)。此外，研究基于Ro/e分析对这些细胞亚群进行了组织富集分析，结果观察到肥大细胞和髓系细胞优先分布在动脉粥样硬化核心(AC)部位，而淋巴细胞优先分布在邻近部位(PA)(图1e)。接着研究对AC和PA之间的免疫细胞进行分析发现与PA样本相比AC样本的肥大细胞和髓系细胞与缺氧相关(图1f)。

2. 动脉粥样硬化斑块中T细胞和ILC细胞的分离和聚类

这一部分研究对动脉粥样硬化病变中T细胞和ILC细胞的谱系和特征进行了分析。研究先将24183个T细胞和ILC细胞聚成13个亚群，并注释为4个CD4⁺ T细胞亚群、6个CD8⁺ T细胞亚群和3个ILC亚群(图2a-c)。接着研究根据Ro/e指数，发现CD8-C5-GZMB T细胞主要分布在PA中，而CD8-C3-IFI44L和CD8-C6-TOP2A T细胞则相反(图2d)。此外，研究也观察到CD8-C3-IFI44L T细胞的浸润随着疾病进展而增加(图2e)，这些细胞中IFN诱导基因表达也较高且富集到IFN相关通路(图2f, g)。研究也发现CD8-C6-TOP2A T细胞同时表达了增殖，毒性和耗竭相关基因，并且优先分布在AC中(图2b)。

3. 轨迹分析揭示致病性活化的CD4⁺T细胞亚群

这一部分作者对CD4⁺和CD8⁺ T细胞进行了伪时序分析。作者根据动脉粥样硬化斑块中T细胞的发育轨迹推断T细胞的谱系结构，发现CD4-C1-SELL T细胞位于与CD4-C4-GZMA T细胞相反的一端，而CD4-C2-CXCR5 T和CD4-C3-FOXP3 T细胞主要位于中心(图3a)。由于CD4-C4-GZMA细胞分化为两个不同的分支（细胞命运1及细胞命运2），作者为了研究这种异质性的潜在机制对命运1细胞和命运2细胞进行了富集分析(图3b)，并分析了命运2细胞的组织分布，结果观察到其在晚期斑块中比例较高(图3c)，此外生存分析显示，这些细胞与动脉粥样硬化的不良预后显著相关(图3c)。接着作者预测了命运2细胞中上调基因的转录调控因子，并利用Cytoscape构建了调控网络(图3d)，结果观察到伪时序进程中炎症调控因子显著上调(图3e)。总之，这些结果表明，这些促炎活化T细胞的存在可能驱动动脉粥样硬化病变的进展。

4. 动脉粥样硬化病变中髓系细胞的分离和聚类

这一部分研究对髓系细胞进行了谱系和特征分析。作者首先将13963个髓系细胞重聚为14个亚群，分别为DC-C1-CLEC9A (cDC1s)、DC-C2-CD1C (cDC2s)、DC-C3-FSCN1(成熟DC)、DC-C4-IL3RA (pDC)、Mono-C1-CD14(经典型单核细胞)、MonoC2-CD14-CD16(中间单核细胞)和MonoC3-CD16(非经典型单核细胞)细胞，以及7个不同的巨噬细胞亚群(图4a)。接着作者根据标记基因的表达和功能特征识别了动脉粥样硬化浸润髓系细胞亚群特征(图4b、c)。此外，作者基于Ro/e指数观察到HLA-DR和互补基因低表达的细胞优先分布在AC中(图4b, d)。研究进一步比较单核细胞亚群，发现中间型单核细胞最多，经典型单核细胞最少，这些亚群都主要分布在PA中(图4a, d)，功能分析发现经典单核细胞主要富集于趋化和迁移相关通路，而非经典单核细胞表现为促炎表型(图4e)。作者在7个巨噬细胞亚群中发现C1对应于IFINC巨噬细胞；C2、C3对应炎性巨噬细胞；C4对应巨噬细胞；C5亚群表达促纤维化标志物； C6和C7表达泡沫细胞相关基因(图4f)。接着Ro/e分析发现炎性和常驻巨噬细胞主要在PA中，而泡沫状巨噬细胞主要在AC中(图4d)。

5. 功能失调的泡沫巨噬细胞及其潜在调控关系的识别

这一部分研究对两种泡沫巨噬细胞进行了刻画。研究首先分析了两种泡沫巨噬细胞中TREM2介导的功能，结果观察到脂蛋白颗粒清除及胆固醇酯化等调节通路在TREM2⁺C6泡沫巨噬细胞中显著上调(图5a)，而SPP1⁺巨噬细胞中与溶酶体和胆固醇酯化相关的评分显著降低(图5b)。此外，研究也发现与TREM2⁺巨噬细胞相比，SPP1⁺细胞显示出显著较高的内质网应激、凋亡和自噬及血管生成评分(图5b)。研究也在晚期动脉粥样硬化和斑块内出血病变中检测到SPP1⁺巨噬细胞浸润(图5c)。接下来研究对单核细胞和巨噬细胞进行了伪时序分析，观察到轨迹起源于单核细胞，并分成不同的发育轨迹，中间单核细胞连接到SPP1⁺泡沫巨噬细胞，并富集了脂质和胆固醇代谢通路(图4e)。通路富集分析也显示代谢通路在具有不同分化命运的细胞中显著富集(图5d)。研究接下来使用SCENIC分析了SPP1⁺泡沫巨噬细胞的调控序列，其中包括SOX13, PAX8，THAP11，PPARG和CEBPE调控(图5e)。随后，研究使用NicheNet分析研究了SPP1⁺泡沫巨噬细胞的外部调节因子，结果发现CSF1可能作为配体驱动SPP1⁺泡沫巨噬细胞(图5f)。此外，CellphoneDB结果也表明肥大细胞更可能与SPP1⁺泡沫巨噬细胞相互作用(图5g)。此外，研究在组织数据中也发现CSF1在动脉粥样硬化斑块进展过程中表达显著增加(图5h)，且在动脉粥样硬化病变中肥大细胞和SPP1⁺泡沫巨噬细胞的比例也正相关(图5i)。

6. 巨噬细胞在内的细胞类型特异的代谢程序

这一部分研究对细胞类型特异的代谢程序进行了介绍。研究首先使用scMetabolism计算了77条代谢通路的活性评分，发现髓系细胞在AC和PA的代谢评分均最高(图6a)。接下来研究根据代谢评分对巨噬细胞进行排序(图6b)，结果发现TREM2⁺泡沫巨噬细胞的代谢活性最大，而SPP1⁺泡沫巨噬细胞的代谢活性相对较低(图6b)。对两个亚群之间代谢通路的进一步分析也发现25条代谢通路在SPP1⁺泡沫巨噬细胞中上调，52条代谢通路在TREM2⁺泡沫巨噬细胞中上调(图6c)。此外，研究观察到SPP1⁺泡沫巨噬细胞中缺氧评分最高(图6d)，研究也发现缺氧与糖酵解显著相关，而线粒体程序则相反(图6e)。为了证明代谢重编程和巨噬细胞表型改变之间的联系，研究进一步分析了25条上调的代谢通路与SPP1⁺泡沫巨噬细胞表型评分之间的关系，结果发现巨噬细胞特异性代谢过程与自噬、凋亡和内质网应激相关(图6f)。接着对SPP1⁺泡沫巨噬细胞中上调的代谢和标记基因进行的分析表明，MIF和FBP1是潜在的代谢调节靶点(图6g)。

7. 浸润性免疫细胞之间的细胞间通讯以及免疫细胞特征和患者生存之间的相关性

文章最后一部分对免疫细胞间的通讯及与患者预后之间的关联进行了介绍。研究首先利用CellChat构建了细胞间的通讯网络，观察到PA区域比AC区域具有更多的细胞间相互作用(图7a, b)。接着研究观察了髓系亚群之间的细胞通信，识别了在AC或PA中富集的23条信号通路(图7c)，并进一步观察了SPP1⁺泡沫巨噬细胞与所有巨噬细胞亚群的相互作用(图7d, e)。此外，研究还对重要通路的信号及受体水平变化进行了详细分析(图7f)。最后研究使用了一个更大的队列，评估了每个巨噬细胞亚群和患者人群的风险比，结果发现TREM2⁺泡沫巨噬细胞水平与较好的疾病预后相关(图7g)，而较高丰度的SPP1⁺泡沫巨噬细胞与较差的预后显著相关(图7g)。

到这里这篇文章的主要内容就介绍完了，文章结合了组织及单细胞数据，对动脉粥样硬化的免疫异质性进行了全面的刻画，并识别出了潜在的免疫治疗靶点。文章使用差异分析，富集分析及伪时序分析等方法从多个角度分析了动脉粥样硬化病变中免疫浸润的特征，内容丰富，逻辑清晰，值得小伙伴们参考学习。