大家好!今天跟大家分享的文献是2022年1月发表在Frontiers in Cell and Developmental Biology(2022年IF=5.85)杂志上的一篇文章。文中涉及TCGA头颈部肿瘤(HNSCC)队列(TCGA- HNSCC)和GEO头颈部肿瘤队列(GEO- HNSCC)两个研究队列,鉴定出与HNSCC患者的预后,纤维化,缺氧,糖酵解相关基因signatures。快来看看这么多表型,作者是怎么设计嵌套的吧。
背景介绍:
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGFs) 是一类多功能多肽生长因子家族,至少有28个不同的成员,典型的FGF通过结合并激活酪氨酸激酶FGF受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR),触发生物活性有关的细胞内信号级联反应。在胚胎发育过程中,FGF通过调节细胞增殖、分化和迁移在形态发生中发挥关键作用。在成人中,FGF作为稳态因子参与调控组织修复和伤口愈合、神经系统控制和肿瘤血管生成等。
FGFRs是免疫球蛋白(Ig)超家族的跨膜酪氨酸激酶受体,它们各自被高亲和力FGF配体激活导致激酶激活,从而导致细胞内信号网络的激活。在人类中,FGFR家族由4种跨膜受体酪氨酸激酶(RTKs)组成,即FGFR1到FGFR4。FGFRs作为抗肿瘤最有潜力的靶点之一,目前已有多个临床试验检验FGF/FGFR相关药物的抗肿瘤作用。
缺氧作为一个相对上游的事件,可以通过影响下游事件,进而影响疾病的发生发展及治疗。如肿瘤微环境中存在时空梯度的氧扩散和消耗,导致多数实体肿瘤的亚区具有低水平的分子氧,即为缺氧。这些区域的大小和范围各不相同,它们的出现是由于供氧减少(肿瘤血管紊乱和不规则)或耗氧增加(肿瘤代谢变化)。肿瘤对这种氧供需失衡的适应与不良临床预后、基因组不稳定性升高、化疗和放疗耐药性升高、免疫抑制、肿瘤干细胞保护生态位发育和远处转移倾向增加相关。
正常细胞体内,葡萄糖会维持一个平衡状态,在缺氧状态时,葡萄糖会转变丙酮酸进而转变为乳酸,当氧含量正常时,丙酮酸会进入三羧酸(TCA)循环。而肿瘤细胞的一个普遍特点是即使在氧含量正常的情况下,葡萄糖摄取量和乳酸的积累量也会逐渐升高,利用糖酵解作为主要能量代谢的来源,获得更高的糖分解能力,使得葡萄糖转变为乳酸来产生ATP,这种现象我们称为Warburg效应。Warburg效应代表着肿瘤细胞对葡萄糖利用方式由氧化磷酸化到糖酵解的转变,现在被认为是肿瘤一大特征。
流程图
结果
1. HNSCC纤维化信号及与纤维化相关的DEGs
70个与FGFR信号通路呈正相关的基因被用于评估患者纤维化信号激活状态。
基于UMAP算法,作者使用纤维化相关表达矩阵将患者分为两个cluster,将每个患者分配到最近的cluster (图2A)。Kaplan Meier图表明,两个cluster之间存在显著差异(图2B)。cluster 1和cluster 2分别有309例和176例患者。
为了获得纤维化相关的DEGs,我们比较了cluster间的表达谱。在cluster1中,总共有187个与纤维化相关的DEGs过表达,在cluster1中,患者的预后较差,DEGs富集分析显示在response to wounding(图2C), TGF - β信号通路富集(图2D)。这意味着cluster 1的患者处于更高的纤维化激活状态。富集分析显示,在cluster2中过表达的186个DEGs中富集在immunoglobulin complex (图2E),metabolism of xenobiotics cytochrome P45 0(图2F)。提示免疫状态良好的患者预后较好。
2. HNSCC的缺氧状态、糖酵解状态和缺氧糖酵解相关的DEGs
接下来作者利用GSVA包的ssGSEA算法来量化每个HNSCC患者缺氧或糖酵解富集评分(缺氧或糖酵解基因集来自MSigDB)。为了解缺氧和糖酵解对HNSCC患者预后的影响,对HNSCC缺氧和糖酵解评分进行单因素Cox回归分析。如图3A的森林图所示,缺氧和糖酵解是HNSCC患者预后的危险因素。作者根据缺氧(图3B)和糖酵解(图3C)评分将患者分为两组。将缺氧和糖酵解状态合成为一个二维指数,将患者分为三组,即高缺氧/糖酵解高组、低缺氧/糖酵解低组和混合组。三组间的生存率有显著差异(图3D)。高缺氧/糖酵解高组的OS优于低缺氧/糖酵解低组(图3E)。
高缺氧/糖酵解高和低缺氧/糖酵解低组的差异分析提示,缺氧糖酵解相关DEGs共108个
3. TCGA数据集中纤维化缺氧糖酵解相关预后模型的构建
将上述从HNSCC中鉴定出的334个与纤维化相关的DEGs和108个与缺氧糖酵解相关的DEGs取交集,得到39个关键基因(图4A)。为了进一步筛选预后相关的DEGs,作者取cox分析中21个预后显著相关的基因(图4B)。其中18个基因的风险值较高。LASSO回归从上述21个预后DEGs中选取6个关键基因,其中4个高风险因素, 2个为保护因素 (图4C,D)。对于每个HNSCC患者,根据6个关键基因的表达水平和LASSO Cox回归的相应系数计算风险评分,根据患者的风险评分将患者分为高、低风险组(图4E)。低危组预后优于高危组(图4F)。
4. 预后模型及其与免疫细胞浸润关系的补充信息
作者根据风险评分分组,对483例HNSCC患者进行了生存分析。根据原发肿瘤的位置进行了亚组分析。在舌和咽喉(图5B,D),发现高危组患者预后较差。扁桃体、下咽同样(图5A、C)。单因素Cox回归分析显示,风险评分可作为评估HNSCC患者预后的独立危险因素(图5E)。
作者还利用ssGSEA算法评估患者的免疫细胞浸润水平。作者对6个基因与免疫细胞浸润评分之间进行了相关性分析(图5F)。与低危组相比,高危组的患者8个特异性免疫细胞的浸润水平显著减少,包括活化的B细胞、未成熟B细胞、活化的CD4 + T细胞、活化的CD8 + T细胞、效应记忆CD8 + T细胞、MDSCs和肥大细胞(图5G)。
5. GEO数据集中纤维化缺氧糖酵解相关预后模型的外部独立队列验证
作者上述 分析确定了纤维化+缺氧+糖酵解为基础的预后模型在独立队列GSE41613中得到进一步验证。在97例OSCC患者的表达矩阵中,有5个模型中的基因。患者临床资料如表2所示。
单变量Cox回归结果提示AREG、THBS1、SEMA3C、ANO1独立危险因素。而EPHX3是保护因素,与作者利用TCGA建议的模型一致(图6A)。作者根据基因表达水平将患者分为两组(图6B、D、F、H、J),并进行生存分析(图6C、E、G、I、K)。Kaplan Meier曲线显示,预后模型中4个风险基因表达水平较高的患者OS较差(图6C,E,G,I),而保护基因表达水平相反(图6K)。
6. 预后模型的免疫组化分析(HPA+自有石蜡切片)
为了进一步验证预后模型中基因表达,作者对头颈部鳞状细胞癌石蜡切片进行了免疫组化染色分析。免疫组化染色分析显示,抗体ab135842(图7A F)和ab134050(图8A F)定量的HNSCC组织中SEMA3C和IGHG2的表达略高。根据HPA的蛋白表达数据,我们比较了6基因签名蛋白在头颈部HNSCC组织和鳞状上皮(口腔鳞状上皮)中的表达。发现这些基因的蛋白表达在HNSCC和正常组织中存在差异。
7. 基于scRNA-Seq的HNSCC患者纤维化相关免疫图谱
为了进一步了解纤维化信号与免疫的相关性,作者分析了GEO数据集GSE139324的scRNA-seq数据。共使用23个样品进行分析。其中,18个样本为来自HNSCC患者的肿瘤组织浸润免疫细胞,5个样本为来自健康供体扁桃体的组织内免疫细胞,分类为20个细胞簇。此外,在HNSCC患者和健康供体(HD)之间,每个细胞亚群的数量有显著差异(图9A)。
通过多种细胞表面和细胞内标记物的表达,cluster 4和cluster 11被定义为单核细胞。cluster 3、cluster 9、cluster 13、cluster 14和cluster 20表达与B细胞相关的标记物 (如CD79A),其余cluster表达与T细胞相关的基因(如CD3D) (图9B)。
图9C、D分别显示低OS患者中FGF受体信号相关基因高表达和DEGs高表达的细胞,其中大部分在cluster 4和cluster 11中高表达。与健康对照组相比,患者的单核细胞组成明显更高(图9E)。在HNSCC和HD中,cluster 4和cluster 11的细胞数量有显著差异(图9F,G)。热图表明上述基因在单核细胞中比在其他种类的免疫细胞中更丰富(图9H)。
总结
作者通过差异分析,将FGFR信号通路相关的基因、缺氧相关的基因和糖酵解相关的基因整合建立一个预后模型,在TCGA-HNSCC患者的预后相关,并利用GEO-HNSCC验证模型的效能。单细胞分析内容,将模型中的基因与单核细胞建立联系。多个表型,联合单细胞分析,故事讲的完整。
这里有两个值得我们思考的地方:
1.作者在用外部数据集验证模型的时候,其中有1个基因没有被鉴定出来。所以作者做了其余5个基因的生存分析进行验证。这种情况,小编以前也遇到过,通过机器学习得到的模型中的基因,并没有在验证集中找到,最后只能放弃这个模型。这次看到作者单个基因验证的方法也可以将论文发表出来,以后也可以效仿一下哈;
2.FGFR联系到缺氧、糖酵解,不同于基因集的分析套路,相当于三个表型,可以又多个组合模式,生信的挖掘深度越来越吃专业背景了,吸人眼球的思路还是得听需要专业人士来摆一摆哦~
1. Shi M, Zhu J, Wang R, et al. Latent TGF-β structure and activation. Nature. 2011;4747351:343-349.
2. Annes JP, Chen Y, Munger JS, Rifkin DB. Integrin alphaVbeta6-mediated activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-beta binding protein-1. J Cell Biol. 2004;1655:723-734.
3. Ge G, Greenspan DS. BMP1 controls TGFbeta1 activation via cleavage of latent TGFbeta-binding protein. J Cell Biol. 2006;1751:111-120.