癌细胞耐药性和可塑性是导致癌症治疗失败的主要原因,而研究治疗过程中肿瘤内细胞亚群的进化对解析癌症耐药性及可塑性至关重要。因此,小编今天和大家分享一篇今年10月刚刚发表在Genome Medicine(IF:15.266)杂志上关于细胞进化与耐药的文章。文章提出了一种新的策略,可以根据患者特异性肿瘤亚群在放疗(RT)或细胞毒性治疗时发生的变化来设计癌症治疗。文章聚焦肿瘤内细胞进化与耐药性的关联,逻辑清晰,角度新颖,有理有据,很具有参考及启发意义。
Computational quantifcation and characterization of independently evolving cellular subpopulations within tumors is critical to inhibit anti-cancer therapy resistance
定量及刻画肿瘤内独立进化的细胞亚群对抑制抗癌治疗耐药性至关重要
一.研究背景
目前耐药性是限制抗癌疗法效果的主要因素,引起癌症耐药的一个主要原因是癌症的可塑性,即一种癌症亚型会根据治疗的不同而转变为另一种癌症亚型,例如,三阴性乳腺癌(TNBC)在治疗过程中可能会转变为Her2阳性乳腺癌。此外,肿瘤诊断的准确性和后续治疗的决策对治疗效果至关重要。因此,该研究评估了一种新的方法来刻画治疗诱导的肿瘤细胞亚群进化,并对癌症治疗耐药的机制进行了解析。
二.文章摘要
该研究基于信息论开发了一种能够探索肿瘤组成的单细胞量化策略,且该策略有助于抗癌疗法的高分辨率及个性化评估。该单细胞量化策略首先构建每个细胞的特异性信号特征(CSSS),然后基于CSSS计算细胞的条码(barcodes)。最后使用基于CSSS的barcodes揭示肿瘤内为响应外部影响而产生的进化,并据此进一步为肿瘤分配靶向药物来优化肿瘤治疗。此外,研究也通过TNBC模型和放疗中存在表型切换的患者对研究结果进行了验证。
三.研究的主要内容及结果
1. 研究的总体流程
文章首先对研究的总体流程进行了介绍,该研究主要分为4部分:1)首先是通过文献检索确定了能够用于单细胞定量和分析的乳腺癌细胞表面标记物。2)接着使用靶向细胞表面癌蛋白的荧光标记抗体对单细胞悬液进行标记,并检测每个细胞的癌蛋白的表达水平(图1A)。3)接着应用单细胞惊异分析(Surprisal analysis;SA)来识别每个细胞的特异性信号特征(CSSS),进而识别肿瘤内不同的细胞亚型(图1B)。4)最后进行了一系列体外和体内实验对研究结果进行验证(图1C)。
2. CSSS分析
这一部分作者对CSSS分析过程进行了详细介绍。研究首先对乳腺癌相关的癌标志物进行文献搜索并选择了11个细胞表面蛋白进行单细胞量化。这11个标志物为Her2、EGFR、EpCAM、CD44、CD24、PD-L1、cKit、CD133、E-Cadherin、cMet和MUC1。其中EGFR, Her2, MUC1,cMet和cKit与侵袭性表型的乳腺癌增殖相关;EpCAM, E-Cadherin, CD133, MUC1,cMet和cKit则与癌症转移和侵袭相关;而CD44, CD24, CD133与干细胞特性相关;PD-L1则与免疫应答有关;此外,Her2, cMet, EGFR, MUC1, cKit, PD-L1也是乳腺癌治疗的潜在药物靶点。接下来,研究使用多色流式细胞荧光分选(FACS)方法对单细胞中的这11个标志物进行定量(图2A),并据此对单细胞进行SA分析(图2B,C)。接着研究保留细胞具有显著振幅的过程,进而识别了细胞特异性过程,并称之为“细胞特异性信号特征”(CSSS)(图2D)。此外,研究为了简化将每个CSSS转换为细胞特定的条码,图形化地表示细胞中的一组活动过程(图2D)。接下来,研究基于细胞匹配的CSSS识别了不同的亚群(图2E),并研究了CSSS与治疗策略的关联(图2F)。
3. 在4T1小鼠的TNBC细胞中10个不平衡过程会引起11种细胞表面蛋白的表达变化
这一部分研究使用TNBC模型对不平衡过程与细胞表面蛋白的关联进行了介绍。研究中使用的第一个TNBC模型中包括4T1细胞,该细胞来源于小鼠的乳腺肿瘤代表IV期的TNBC。研究发现Her2和cMet表达水平(图3A)以及其他标记物会在放疗(RT)的作用下发生改变,不过cMet和Her2的表达相关性不显著(图3B),相反地EGFR和Her2及MUC1和cMet则表现出很强的相关性(图3C,D)。接下来为了探索所有可能的蛋白与蛋白之间的关系,研究进行了单细胞SA分析,该方法可以识别和定位在整个细胞群和每个细胞中发生的不平衡过程,结果在细胞群中识别了10个不平衡过程,作者展示了4个出现在大于1%的细胞中的过程(图3F)。其中过程3和8包括Her2和EGFR及cMet和MUC1的诱导(图3F)。
4. 在RT反应中观察到Her+和cMet+亚群的扩张
由于每个细胞中可能存在多个不平衡过程,因此这一部分作者对每个细胞的CSSS进行分析,并揭示了基于CSSS的细胞亚群。研究首先在RT前后的细胞群中发现了8个优势亚群,并将每个亚群进行编码(图3G)。接下来研究分析了放疗时间与优势亚群的关联,结果发现亚群c在放疗6天后下降。然而,亚群b和f在放疗6天后显著增加(图4A)。其中,亚群b中只存Her2和EGFR诱导相关的过程3,而亚群f中只存在cMet和MUC1诱导相关的过程8(图4A)。这种在放疗后的Her2+和cMet+亚群的扩张表明,Her2和cMet信号通路可能在4T1细胞的生存和对RT的抵抗中发挥重要作用。接下来,为了刻画扩张的Her2+和cMet+亚群在RT反应中的增殖特性,研究使用免疫荧光法将4T1细胞群与抗ki67(增殖生物标志物)、抗cMet和Her2抗体联合染色。结果在存活的RT细胞中观察到Ki67、Her2和cMet的表达显著增加(图4B、C、E和F)。此外,Her2和Ki67蛋白以及cMet和Ki67蛋白也协同增强(图4D,E)。
5. 同时抑制Her2和cMet可致敏4T1 TNBC模型的RT治疗
这一部分,作者对Her2和cMet抑制与4T1 TNBC模型的RT治疗敏感性的关联进行了分析。研究从放疗前3天开始直到放疗后6天,单独或联合抑制每种蛋白质,之后测量细胞存活率。结果发现Her2抑制剂和cMet抑制剂在使细胞对RT敏感方面显示出协同效应(图4H)。这两种抑制剂与RT的联合使用增加了细胞死亡,并减少了下游对Her2和cMet的信号传导(图4I)。为了进一步验证这一结果,作者将4T1细胞植入小鼠,并对肿瘤采用放疗(图5A),接着切除4T1肿瘤对单细胞悬液进行分析,结果观察到肿瘤在放疗初始收缩(图5B),后续则发生亚群b和f的扩张(图5C)。此外,在放疗后12天肿瘤恢复生长时(图5B),这些扩张的亚群仍然能够被检测到(图5C)。此外,研究也观察到抑制Her2和cMet蛋白(5D)会显著使肿瘤对放疗敏感(图5E),且联合治疗会导致肿瘤缩小,并阻止RT耐药的发展(图5E)。此外,在RT之前加入靶向药物组合,也会使b和f亚群的大小显著减少(图5F)。
6. 靶向Her2和cMet使人细胞系和患者源性TNBC对RT敏感
这一部分为了进一步验证Her2+和cMet+细胞亚群的扩张与TNBC的关联,研究纳入了TNBC人源性细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468以及TNBC患者源性细胞(BR45)进行了验证。结果在放疗后6天,观察到所有类型的细胞生长受到抑制,随后在放疗后14天出现显著的细胞再生(图6A)。而且在所有细胞类型中,b和f亚群在放疗后6天扩张,在放疗14天后要么保持其大小,要么扩张(图6B)。接下来,研究发现抗Her2和抗Met的联合预处理能够使3种类型的人TNBC细胞对RT敏感(图6C)。此外,与两种药物与RT联合使用相比,每一种药物单独对细胞存活的影响明显较小(图6C)。进一步当细胞被抗Her2和抗cMet预处理时,研究观察到下游的Her2和cMet信号通路损耗(图6D)。接下来,研究使用患者源性TNBC BR45细胞,证明了放疗的BR45 TNBC会在短时间内对放疗产生耐药性(图6E)。接着研究在放疗前单独用每种药物对小鼠进行预处理,结果发现肿瘤生长在一定程度上被抑制(图6E)。然而,作者联合使用这两种药物对小鼠的处理时,则观察到它们展示出与放疗显著的协同效应,肿瘤显著缩小且耐药的发展也受到抑制(图6E)。此外,当靶向联合药物在放疗前应用时,b和f亚群也减少(图6F)。
到这里这篇文章的主要内容就介绍完了,文章开发了一种在单细胞水平探索肿瘤内部进化异质性的方法,并以乳腺癌为例探索了治疗诱导的肿瘤进化与耐药性的关联,同时对实验结果进行了体内及体外实验验证。文章内容丰富,干湿结合,有理有据,对外部影响诱导的肿瘤进化进行了详细刻画,文章将肿瘤进化与耐药联合分析的研究思路值得我们参考。