大家好，今天给各位分享的文献是2022年8月份发表在Nature cancer（IF=23.17）的文章。横纹肌肉瘤中细胞发育层次和起源目前还不是特别清楚，本文利用单细胞测序技术分析了其发育情况，并发现了一群增殖细胞亚群，其特征与双潜能肌肉间充质祖细胞有很大相似性。

Single-cell analysis and functional characterization uncover the stem cell hierarchies and developmental origins of rhabdomyosarcoma

单细胞分析和功能表征揭示了横纹肌肉瘤的干细胞层次和发育起源

摘要：横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma，RMS）是一种常见的儿童癌症，其特征与发育中的骨骼肌相同。然而，与人类肌肉发育细胞层次守恒和肿瘤增殖细胞的关系还没有报道。利用单细胞RNA测序、DNA条码细胞命运图谱和功能干细胞分析，作者揭示了RMS和人类肌肉发育中共享的肿瘤细胞层次。作者还确定了肿瘤细胞被捕获的常见发育阶段。在7-7.75周龄从胚胎发育到胎儿发育的肌肉细胞中发现，融合阴性的RMS细胞（Fusion-negative RMS，FN-RMS）类似于在胚胎和胎儿发育中发现的早期肌原细胞，而融合阳性的RMS（Fusion-positive RMS，FP-RMS）细胞表达了一个高度特异性的基因程序。融合阳性的RMS细胞也有神经通路富集状态，表明肌肉谱系分层没有那么严格。最后，作者在融合阴性RMS中发现了一个肿瘤增殖亚群，该亚群与既能制造肌肉细胞又能制造成骨细胞的双潜能肌肉间充质祖细胞有显著的相似性。

研究背景：许多癌症含有分化程度较低的细胞类型，这些细胞具有自我更新和增殖能力，从而推动肿瘤生长。这些肿瘤增殖细胞（tumor-propagating cells，TPCs）可以分化产生肿瘤内所有细胞类型。TPCs已在急性髓系白血病、乳腺癌和结直肠癌等疾病中被发现。然而，一些癌症没有分级组织，并表现出促进肿瘤生长的极端细胞可塑性，最显著例子就是黑色素瘤。除了确定TPCs在特定恶性肿瘤中驱动肿瘤生长外，目前还不太清楚在预测的起源组织中发现的相同自我更新程序和细胞命运决定是否在癌症中重演。已有发现表明，一部分肿瘤重复利用了在它们原始组织中发现的相同发育干细胞通路，而其他肿瘤则采用新的自我更新程序作为其转化过程的一部分。RMS是儿童最常见的软组织肉瘤，与具有分级组织的骨骼肌存在相同组织病理学特征，使其成为解决这些问题的理想模型。RMS由两种主要亚型组成，包括与FOXO1发生PAX3或PAX7易位的FP-RMS，以及FN-RMS在很大程度上被RAS通路激活转化。虽然常见临床特征决定了治疗方式，但很明显，外加的分子异质性是肿瘤侵袭性和耐药性的基础。事实上，外加的包括P53通路失活在内的遗传扰动是FN-和FP-RMS中发生侵袭性和耐药性的危险因素。尽管基因突变和分子异质性在驱动RMS侵袭性中发挥作用，但两种RMS亚型都表达肌系转录因子，包括MYOD（Myoblast Determination Protein 1，成肌细胞决定蛋白1）、MYF5（Myogenic Factor 5，肌源性因子5）和/或成肌素，并且在整个胎儿、胚胎和成人发育过程中发现形态类似未分化的单核肌细胞，包括生皮肌节、卫星细胞、肌肉祖细胞和成肌细胞/肌细胞。这些数据表明，潜在的肌肉发育途径可能驱动多种RMS肿瘤生长和维持。到目前为止，RMS分子细胞状态与正常人类骨骼肌发育的直接关系还未被报道。也不知道RMS细胞层次在多大程度上再现肌肉中发现的细胞层次，以及肿瘤细胞在人类发育中停滞的成熟阶段。关于RMS的争议源于多种可能的细胞来源，以及缺乏对人类RMS肿瘤细胞异质性（包括维持肿瘤细胞生长的细胞类型）的详细分子描述，这引导作者对人类RMS进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），并与人类肌肉发育进行比较。作者还进行了功能性干细胞分析，以确定FN-RMS中存在很大部分静止的TPC，该TPC在应激后驱动癌症再生。这种FN-RMS TPC与最近描述的制造肌肉和成骨细胞系的双潜能间充质干细胞有显著的相似性。

结果：

1.scRNA-seq显示RMS异质性。

为了研究RMS中细胞状态和肌肉发育层次的守恒，作者对患者来源的异种移植进行了基于10X的scRNA-seq，细胞聚类分析（图1a）。相似基因表达的细胞簇被合并，使用分子特征数据库确定细胞状态（图1b，c）。从分析中，作者发现常见的泛癌细胞状态，包括增殖、缺氧、凋亡、干扰素和内质网应激反应细胞特征（图1d）。作者还发现了RSM特异性细胞状态，包括：（1）分化的肌细胞群表达MYLPF（Myosin Light chain 2，肌球蛋白轻链2），ACTC1（Actin Alpha Cardiac Muscle1，肌动蛋白α心肌1），LRRN1（Leucin Rich Repeat Neuronal 1），TNNT3（Troponin T3，肌钙蛋白T3）和TSPAN33（Tetraspanin-33）；（2）表达细胞外基质和间充质基因包括MMP2（Matrix Metalloproteinase 2，基质金属蛋白酶2）、CD44、PTN（Pleiotrophin，多效生长因子）、POSTN（Periostin，骨膜蛋白）和THY1（CD90）；（3）只在FP-RMS中发现富集神经通路的细胞类型。用FN-MAST85 PDX异种移植的两只小鼠分别进行单细胞测序分析发现移植动物细胞状态基本相似，从另外4个原发性患者样本单核测序中也观察到类似细胞状态组成（图1d）。RMS肿瘤间异质性分析显示绝大多数肿瘤含有分化肌肉细胞（图1d）。通过单细胞测序和IHC评估，一份FN-RMS模型（PDX MAST39及其转移病灶MAST85）和一份FN-原发患者样本（29806）不包含分化的肌肉细胞，这与缺乏分化肌肉细胞类型的RMS亚群的临床表现一致。所有5种FN-RMS肿瘤均含有间充质富集细胞，而5种FP-RMS中只有2种含有这种细胞亚群（图1d）。最后，大多数FP-RMS含有丰富神经通路细胞，这表明FP-RMS肿瘤可能通常采用这些细胞状态作为转化过程的一部分（图1d）。最后，所有患者来源的RMS肿瘤都含有大量不表达上述任何转录基因的细胞，并被指定为“基态”（图1c，d）。这些数据表明，存在四种RMS肿瘤细胞状态，包括增殖细胞、基态细胞、间充质细胞和分化肌肉细胞。

图1 scRNA-seq揭示了人RMS不同细胞状态和肿瘤间异质性。a，实验设计原理图。b，从分子特征库中查询的RMS细胞状态特征。c，热图显示FN-MAST111 PDX的单个细胞和特定转录基因富集。d，单个肿瘤细胞状态。

2．并不是所有RMS细胞都能启动肿瘤生长。

为了测定FN-和FP-RMS PDX模型中肿瘤生长的潜伏期，作者将来自9个PDXs的RMS细胞移植到NSG小鼠中（图2a-c）。为了研究单个RMS细胞是否能重制肿瘤并产生所有后续细胞状态，作者将来自4个PDXs的单个肿瘤细胞植入NSG小鼠侧腹（图2a，d）。4个PDXs中有三个能形成肿瘤，包括两个FN-和一个FP-RMS。scRNA-seq证实，植入单个RMS细胞产生的每个肿瘤都具有相似细胞状态组成。这些结果证实单个肿瘤细胞可以重新填充整个RMS细胞状态，包括FP-RMS中富集神经通路的细胞状态，也表明一些RMSs包含大量TPCs。

图2 单个RMS细胞可以重塑肿瘤内所有肿瘤细胞的异质性。a，实验设计原理图。b，PDX模型中具有代表性的肿瘤生长。c，在两种稀释条件下FN-和FP-RMS之间潜伏期差异。d，与单个RMS细胞移植产生的肿瘤相比，亲本肿瘤的UMAP图和肿瘤细胞状态。

3.FN-RMS细胞含有分子定义的TPC。

为了评估FN-RMS细胞谱系和命运，使用人类FN-RMS RD细胞的LARRY条形码完成scRNA-seq（图3）。重要的是，RD细胞在二维培养和异种移植中都包含相同的四种优势肿瘤细胞状态（图3b）。RD细胞在0.3感染倍数下被慢病毒感染，确保每个细胞集成一个唯一的条形码副本（图3a）。生信分析证实，在LARRY条形码文库中发现的大部分细胞在短期培养后仍保持细胞状态（图3c）。即在实验条件下，亲本细胞和子细胞中共有≥446个条形码（图3d），允许谱系追踪和细胞命运可随时间推移（图3e-g）。正如预期，亲代细胞主要由增殖细胞组成，并在高血清条件下驱动大量肿瘤生长（图3f）。

为了直接研究间充质富集的RMS细胞状态在促进癌症生长中的作用，作者从功能上将肿瘤传播潜能分配给离散群体的FN-RMS细胞。从scRNA-seq中分离出富集FN-RMS的间叶样和分化肌肉亚群，包括两个PDXs（MAST139、MSK7471）和三个RMS细胞系（RD、381T和SMS-CTR）（图4）。使用CD44/CD90或CD90/CHODL抗体组合的流式技术分离RMS细胞，通过定量PCR评估，RMS细胞高度富集间充质细胞状态。三维培养后，在所有五种FN-RMS模型中，尤其是与富含肌肉分化的细胞相比，间充质样细胞产生更多（图4d）且体积更大的肿瘤球（图4e），与反选择的阴性细胞类型或分化肌肉细胞相比，TPCs明显富集（图4f）。

该研究结果随后用小鼠异种移植模型验证。将FACS分选的细胞以极限稀释分析（Extreme Limiting Dilution Analysis，ELDA）方式移植到NSG小鼠体内。间充质富集TPCs在FN-MAST139和FN-MSK74711中都能高效重建肿瘤，尤其是与分化肌肉相比（图5a-c）。移植了富含间叶细胞的TPCs小鼠也表现出更快肿瘤再生时间，患病动物总数也有所增加（图5b）。与反选择细胞或肌细胞分化状态的细胞相比，ELDA证实了间充质富集的分选细胞中TPC富集（图5c）。间充质富集细胞移植产生的肿瘤也具有与大量移植肿瘤相似的组织学和异质性细胞群总数。相比之下，少数由CD44-/CD90-或CD90-/CHODL-细胞产生的肿瘤，根据流式分析和对MF20和TNNT3的免疫组化，间充质富集细胞状态的重建明显较低，分化细胞数量增加。最后，由间充质富集TPCs产生的移植瘤与亲本肿瘤具有相似增殖率，而由间充质阴性细胞产生的移植瘤增殖率明显低于亲本肿瘤（图5e）。这些数据表明，FN-RMS肿瘤含有一种独特的、分子水平上定义的间充质途径富集的TPC，在正常生长条件下大部分是静止的，但当在培养和异种移植小鼠中生长时，它有可能重新进入细胞周期，分裂并产生与亲本肿瘤相同的潜在异质性的肿瘤。

图3 对人FN-RMS RD细胞的LARRY条形码显示，间充质富集细胞亚组分能够在低血清、应激条件下促进肿瘤生长。a，实验设计原理图。b，LARRY条形码库中细胞状态。c，对文库中具有相同LARRY条形码的RMS细胞进行定量，并与scRNA-seq基因表达分配的细胞状态比较。d，显示LARRY库中发现的共享条形码以及在不同条件下生长后的共享条形码Veen图。e，UMAP图和在不同条件下生长的细胞状态的定量。f，分析亲本细胞对肿瘤整体生长的影响，以及高血清（上）、低血清（中）和低血清再调成高血清（下）后的下一代子细胞。g，在不同生长条件下细胞谱系和命运决定。

图4 在FN-RMS间充质富集细胞中发现了肿瘤增殖潜能。a，实验设计原理图。b-e，FN-MAST139细胞亚群富集肿瘤增殖潜能分析。b，流式细胞术分析直接从生长在NSG小鼠体内的PDX肿瘤中收集的FN-MAST139细胞（左）和（右）。c，qPCR证实FACS后细胞状态富集情况。d，PDX MAST139肿瘤球的形成。e，MAST139肿瘤球图像（左）和大小量化（右）。f，杠铃图显示了通过限制稀释肿瘤球法测定的MAST139（139）、MSK74711（74711）、RD、381T和SMS-CTR（CTR）的TPCs百分比差异。

图5 限制性稀释细胞移植证实了FN-RMS间充质富集亚组分在体内具有肿瘤传播潜能。a，CD44+/CD90+间充质富集细胞或CD44-/CD90-MAST139 PDX RMS细胞移植NSG小鼠的图像。b，移植到NSG小鼠后肿瘤再生的潜伏期。c，杠铃图显示FN-MAST139和FN-MSK74711极限稀释细胞移植所确定的TPCs百分比差异。d，对分选细胞群生成的肿瘤进行流式分析。e，RMS分选细胞亚群移植肿瘤的组织病理学分析。

4.RMS与胚胎/胎儿肌肉在分子上有相似之处。

Davicioni等人先前在人RMS中发现了亚型特异性的转录基因程序，这使作者假设亚型特异性转录程序可能与人类肌肉发育的特定阶段阻滞有关。然后将该基因列表与Davicioni等人之前定义的亚型特异性基因进行比较，生成FN-RMS或FP-RMS的高度特异性核心基因图谱（图6a）。正如预期，每个核心基因在所有肿瘤细胞中普遍表达，并且对FN-或FP-RMS具有高度特异性（图6b）。此外，FP-RMS核心基因对Gryder等人定义的PAX3调控基因显著富集，且还包含更大比例的PAX3不调控基因（图6c）。接下来作者使用LISA（Landscape In Silico deletion Analysis，LISA）算法来预测每个核心差异表达基因的转录调控因子。LISA利用大量注释的组蛋白标记染色质免疫沉淀测序（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）和染色质可及性（Chromatin accessibility profiles）数据集，以构建查询到的基因列表调控相关染色质模型。LISA分析显示，PAX3位点在FP-RMS核心基因中富集程度较高（图6c，右图）。相反，FN-RMS核心基因不具有高富集预测PAX3调控基因。为了测试这些亚型特异性核心基因是否也在肌肉发育的特定阶段富集，作者下一步将FP-和FN-RMS核心基因映射到通过scRNA-seq鉴定的人类胚胎、胎儿和成人肌肉细胞群（图6d，e）。FN-RMS核心基因在胚胎和胎儿发育分离出的肌肉细胞中表达，但未在成年肌肉中表达（图6e）。这些发现支持了一种观点，即RMS两种亚型都在胚胎或胎儿肌肉中发现的基因程序中表达，并揭示了FP-RMS细胞表达的转录程序与肌源性细胞从胚胎向胎儿肌肉发育过渡的一个严格控制的发育阶段相关。

图6 RMS亚型具有共同基因表达模式，并在胎儿和胚胎肌肉发育的不同阶段被阻止。a，亚型特异性的核心基因通过scRNA-seq数据获得。b，在FP-（左，MAST95）和FN-（右，MAST39）RMS中，不同细胞状态下具有代表性的亚型特异性基因表达点图。c，比较FP-和FN-RMS核心基因与Berkeley等人鉴定的PAX3结合基因的Veen图（左）。LISA分析显示了调节FP-或FN-RMS核心基因的最高预测转录因子结合位点（右）。d，胚胎、胎儿和成人骨骼肌scRNA-seq图。e，组合亚型特异性核心基因（左）和代表基因（右）在正常肌肉发育中的表达情况。

5.RMS细胞与胚胎/胎儿肌肉共享干细胞层次

为了研究不同RMS细胞状态是否与人类胚胎和胎儿发育中发现的相似，作者评估了RMS和正常人类肌肉之间的基因表达模式。作者富集了来自胚胎、胎儿和成人发育中的人类肌肉祖细胞、肌细胞/成肌细胞和骨骼肌间充质干细胞/祖细胞的scRNA-seq中RMS转录基因（图7a）。RMS增殖基因在6-7周龄胚胎骨骼组织的人类肌肉祖细胞中富集（图7b），反映了与细胞周期和这些细胞在发育过程中快速扩张相关的共享肌肉特异性转录程序。相比之下，分化的RMS肌肉转录基因在6-7周、9周和12-14周龄的肌细胞/成肌细胞中富集（图7a，b）。值得注意的是，间充质富集的TPC信号在SkM Mesen干细胞中优先表达。胚胎发育9周和12-14周间质细富集分数为负（图7a，b）。如正常SkM Mesen干细胞一样，这些间质富集的TPCs也独特表达成骨基因OGN（Osteoglycin，骨球蛋白）和MGP（Matrix Gla protein）（图7c）。作者通过qPCR和抗体共染色验证了OGN和MGP在FACS分离的间充质强化RMS细胞中高表达（图7d）。这些数据验证了RMS TPCs与SkM Mesen干细胞的显著相似性。接下来，作者从功能上评估了FN-RMS间充质富集TPCs生成成骨细胞的能力，如果这些细胞与双效SkM在转录和功能上有相似性，就可以预测这些细胞类型。从FN-MAST139、RD和381T细胞中分离出FACS分选的间充质细胞、分化的肌肉细胞或反选择细胞，在成骨分化培养基中培养18天（图7e，f）。来自所有三种模型的间充质富集TPC产生了更多茜素红S⁺成骨细胞系，而反选择和分化的肌肉细胞不能有效地产生成骨细胞（图7e，f）。这些数据支持FN-RMS TPCs和最近定义的双潜能SKM Mesen干细胞之间共享干细胞状态和功能。

图7 间充质富集的FN-RMS TPCs在转录和功能上与双效SkM.Mesen有相似之处。a，人类肌肉细胞scRNA-seq图谱。b，GSEA评估正常肌细胞亚群中RMS细胞状态表达。c，细胞状态（左）和标记间充质富集RMS细胞的骨球蛋白（OGN）、基质Gla蛋白（MGP）和CD90的基因表达（右）。d，qPCR验证来自PDX MAST139和MSK74711的FACS分离的间充质富集RMS细胞中的OGN和MGP。e，使用MAST139细胞的成骨分化实验。在成骨分化培养基中生长18天后，用茜素红S染色的MAST139图像（左）和量化（右）。f，FACS分离的RD和381T细胞在成骨分化培养基中培养后茜素红S染色的定量。

结论：总之，该研究工作揭示了人类肌肉发育和RMS之间潜在的细胞层次结构的显著守恒。作者还在FN-RMS中发现了一个分子水平定义的、基本为静止的TPC，该TPC在分子、发育和功能上与新描述的双潜能肌间充质干细胞/祖细胞有相似之处。

参考文献：Wei Y, Qin Q, Yan C, et al. Single-cell analysis and functional characterization uncover the stem cell hierarchies and developmental origins of rhabdomyosarcoma[J]. Nat Cancer. 2022,3(8):961-975.