在组成细胞的生物分子中，脂质通常比蛋白质和核酸受到更少的关注。有研究证明脂质代谢的改变与癌症的发展和进展有关。今天小编给大家介绍一篇2023年3月发表在BMC cancer（IF:4.638）上一篇名为OSBPL家族基因在肝癌中的表达、免疫浸润、预后及实验验证的文章，文章充分利用了公共数据库的资源，逻辑清晰，实验完整，下面让我们详细的看一下吧。

一、背景

脂质（Lipids）具有丰富多样的生物学功能，既能作为储能物质，又能充当信号分子，还是细胞膜结构的关键成分。有研究发现脂质代谢的改变与癌症的发展和进展有关。肿瘤微环境中营养物质的可用性不断变化，癌细胞利用脂质代谢获取癌细胞增殖、存活、侵袭、转移以及对肿瘤微环境和癌症治疗响应所需要的能量、生物膜成分和所需的信号分子。

氧固醇结合蛋白样（OSBPL）家族是真核生物中脂质结合/转移蛋白（LTP）的最大家族之一，参与脂质结合和转运，OSBPL家族位于细胞膜上，在细胞器之间交换分子或信号，并作为的必要转运蛋白，在肿瘤发生中起关键作用。OSBPL蛋白家族包括9个成员，分别是OSBPL2、OSBPL3、OSBPL5、OSBPL6、OSBPL7、OSBPL8、OSBPL9、OSBPL10和OSBPL11。本文作者将目光投向了OSBPL家族，探究其在肝癌的基因表达、免疫浸润和预后等方面的影响。

二、主要思路

图1 本实验设计流程图

本文通过分析RNA-seq数据和CPTAC的蛋白质数据，分别评估肝脏肿瘤和正常组织中OSBPLs的表达差异。随后对遗传变异、潜在功能富集分析和免疫细胞浸润进行分析。此外，通过构建LASSO模型和进行受试者工作特征曲线(ROC)分析，确定OSBPLs的预后影响。并选取10例局部肝癌标本，通过免疫组化(IHC)方法验证OSBPL3的表达。最后通过CCK-8、细胞周期、凋亡、RT-qPCR、蛋白印迹等方法探讨OSBPL3在肝癌细胞中的功能。

三、主要结果

1. 肝癌组织中OSBPLs的mRNA和蛋白表达

本文通过分析TCGA数据中肝脏肿瘤和与其匹配的正常组织(50对)中OSBPLs的mRNA表达，发现OSBPL2、OSBPL3、OSBPL5、OSBPL7、OSBPL8和OSBPL9均上调(图2a)。为了进一步证实它们在更大队列中的表达，本文使用了160例正常肿瘤和371例TCGA和GTEx肿瘤样本，发现OSBPL2、OSBPL3、OSBPL8在肝脏肿瘤中过表达，而OSBPL6在肝脏肿瘤中下调(图2b)。

利用CPTAC数据库检测肝脏肿瘤组织和正常组织中OSBPLs的蛋白表达，发现肿瘤样本中OSBPL2、OSBPL3蛋白表达升高，而OSBPL5、OSBPL6、OSBPL9、OSBPL10、OSBPL11蛋白表达低(图2c)。

综上所述，本文认为OSBPL2、OSBPL3和OSBPL6可能与肝癌的进展有关。

图2 OSBPLs在肝脏肿瘤组织和正常组织中的mRNA和蛋白表达

2. 肝癌组织中CNV、甲基化与OSBPLs mRNA表达的关系

接下来本文使用了GSCA在线数据库，该数据库汇集了包括CNV、突变、甲基化和免疫在内的各种肿瘤基因组数据，用于评估OSBPLs的CNV和甲基化水平。

对肝癌组织进行了拷贝数变异（CNV）分析，发现OSBPL2、OSBPL3和OSBPL7的CNV均以扩增为主。而OSBPL5和OSBPL9的CNV主要是缺失(图3a)。OSBPL2、OSBPL8、OSBPL9、OSBPL11的表达与CNV呈正相关(图3b)。随后本文评估了DNA甲基化与OSBPLs表达之间的关系。发现甲基化水平与OSBPLs的表达总体呈现负相关(图3c)。计算肿瘤DNA甲基化与正常DNA甲基化的差异。本文发现肝脏肿瘤中OSBPL3和OSBOL9的DNA甲基化表达明显低于正常组织，而OSBPL5和OSBPL7的DNA甲基化表达明显高于正常组织(图3d)。

以上结果表明，CNV扩增主要导致OSBPL2的过表达，而DNA甲基化可能导致OSBPL3的高表达。

图3 肝癌组织中OSBPLs的CNV和DNA甲基化差异

3. 肝癌组织中OSBPLs表达与免疫浸润的关系

作者通过TIMER数据库确定OSBPLs表达与免疫浸润之间的相关性。作者在这里使用了StromalScore、ImmuneScore和EstimateScore三种不同的策略计算OSBPLs的免疫评分，结果显示OSBPL3、OSBPL5、SOBPL7和OSBPL10与免疫浸润显著正相关(图4a)。随后，作者还评估了OSBPL3、OSBPL5、SOBPL7、OSBPL10的表达与不同免疫细胞类型浸润的关系。结果显示，OSBPL3、OSBPL5、SOBPL7、OSBPL10的表达与肿瘤纯度、B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞浸润水平显著相关(图4b)。

图4 OSBPLs表达与免疫浸润的相关性

4. 生存模型构建与分析

作者为了评估基因表达对总生存率（OS）的贡献，将OSBPLs成员输入LASSO回归模型，生成两个关键基因OSBPL3和OSBPL10(图5a-b)。根据风险评分将肝癌患者分为高组和低组，发现高组患者的生存期明显短于低组(图5c)。此外，作者还构建了LASSO回归模型来评估基因表达对疾病特异性生存期（DSS）的影响，其中OSBPL3和OSBPL6是两个关键候选基因(图5d-e)。患者也被分为高、低风险评分组，与低风险组相比，高风险组DSS较差(图5f)。

在这两个LASSO模型中，OSBPL3是唯一与OS和DSS都相关的基因，表明OSBPL3是肝癌的预后因素。

图5 OSBPLs相关风险评分构建。

5. OSBPL3在肝癌中的表达验证

作者进行了ROC分析，评估OSBPL3对肝癌的诊断效力，结果显示OSBPL3是一个较强的预测因子(AUC=0.921, CI= 0.883-0.959)(图6a)。基于以上所有结果，作者发现OSBPL3在肝癌中过表达且与预后相关，假设OSBPL3可能在肝癌的发展中发挥关键作用。为了验证这一猜想，作者分析了4组GEO数据集进行OSBPL3在肝癌中的表达验证，结果显示肿瘤样本中OSBPL3 mRNA显著升高(图6b)。

接下来作者通过免疫组化实验验证OSBPL3的表达，共使用10例与正常相邻组织相匹配的肝癌样本，发现OSBPL3蛋白在10个局部肝脏肿瘤样本中也有高表达(图6c)。

图6 OSBPL3在肝癌中的表达验证

6. OSBPL3在肝癌组织中的GSEA分析

为了更好地了解OSBPL3在肝癌发生中的潜在机制，作者利用RNA-seq数据进行基因表达相关性分析和差异表达基因(DEGs)分析。共鉴定出4441个DEG和2986个与OSBPL3相关的基因(图7a-b)。为了进一步鉴定OSBPL3的功能相关基因，作者将上调的DEGs与正相关基因进行交叉，得到353个交叉基因(图7c)。随后对这353个基因进行GSEA分析，结果显示细胞周期和细胞外基质组织通路明显富集(图7d)。

图7 OSBPL3功能相关基因的GESA分析

7. OSBPL3在肝癌细胞中的功能分析

细胞周期失调和细胞外基质重塑是其重要特征。鉴于GSEA的数据，作者试图确定OSBPL3在细胞增殖和迁移调节中的作用。首先在肝癌细胞系中检测OSBPL3的mRNA表达，结果显示，与其他5种肝癌细胞系相比，OSBPL3在PLC/PRF/5中高表达(图8a)。因此，作者选择了PLC/ PRF/5进行进一步的实验。最终发现敲除OSBPL3可显著抑制细胞增殖，并诱导G2/M细胞周期阻滞(图8b-c)。干扰OSBPL3也促进了明显的凋亡(图8d)。在OSBPL3 siRNA处理后，促凋亡蛋白包括Bax、PARP和cleaved caspase-3被激活(图8e)。此外，转染OSBPL3 siRNA后，细胞迁移明显受阻(图8f)。

图8 敲除OSBPL3抑制细胞增殖和迁移

四、小结

总之，作者评估了肝癌的表达、基因组和表观基因组变异。本文分析思路清晰，逻辑缜密，用简单的生物信息学方法阐述了OSBPL家族在肝癌中的主要表达方式，免疫浸润模式以及找到了一个重要OSBPL家族成员OSBPL3作为重要的预后特征，并分别使用其他数据库数据及免疫组化实验对其进行了验证，最后通过结合功能富集和基因敲除实验确定了下调OSBPL3可诱导G2/M细胞周期阻滞和凋亡，抑制细胞迁移。