肝内胆管癌的免疫亚群具有治疗异质性

免疫微环境被公认为是各种癌症的关键调节因素。肝内胆管癌（iCCA）的特点是肿瘤反应性环境，强调对其免疫基因组学特征的深入了解，以提供癌症的预后和治疗意义。今天分享一篇2022年7月发表在Journal for ImmunoTherapy of Cancer (IF:12.469)杂志的文章。 这篇文章综合多模块数据确定了三个具有不同临床、遗传和分子特征的免疫亚群，这些免疫亚群与预后明显相关。

背景

肝内胆管癌（iCCA）占所有原发性肝癌的10%-15%，在过去几十年中逐渐增加。尽管术后复发率很高，但对于早期诊断的患者来说，手术是优先考虑的治疗方法。但是，大多数患者被诊断为晚期，此时只能进行保守性化疗，其中位生存期短于12个月。iCCA的特点是高度脱髓鞘的肿瘤微环境（TME），有过多的免疫和基质细胞浸润。现有证据表明，炎症微环境与iCCA的进展和不良预后有关，突出了TME是治疗iCCA的一个关键。因此，迫切需要更好地了解免疫基因组学特征，以设计新的免疫疗法，改善病人的预后。

基于免疫谱的患者分层有助于划分免疫异质性肿瘤，并确定适合免疫治疗的患者。已经有研究应用大量的肿瘤转录组或蛋白质组谱来定义临床相关的iCCA亚型，揭示肿瘤间免疫异质性。但目前仍需要对临床前模型和患者样本进行多维度和多模块的综合分析，以深入了解免疫学特征，并确定iCCA各分子亚型的新型个性化免疫治疗机会。

在这项研究中，作者利用最大的单中心iCCA队列分析了TME的转录组图谱，并将255名患者分为三个免疫亚组（IG1、IG2、IG3）。通过整合多种互补方法，包括全外显子组测序（WES）、蛋白质组学、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、免疫染色和小鼠模型，划定了这些亚组之间不同的遗传和分子特征。IG1是一个免疫抑制的亚组，预后最差，拥有最高的骨髓浸润和KRAS突变；IG2的特点是肿瘤增殖和抗原表达缺陷；IG3的特点是抗肿瘤免疫的激活和三级淋巴结构（TLSs）的富集，预后良好。免疫学特征的巨大差异表明，每个免疫亚组都需要特定的治疗策略。

主要结果

以免疫为中心的iCCA分类

为了研究具有预后意义的iCCA的免疫特征，作者获得了来自复旦大学(FU- iCCA)队列(n=255)的多组学数据。与iCCA的炎症和促结缔组织增生特征一致，在癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)泛癌症数据集中，有相对较高的免疫浸润。基于来自TME signature的170个预后基因的mRNA水平，无监督的层次聚类揭示了三个免疫亚组，即IG1、IG2和IG3(图1A)。通过对signature的转录组和蛋白质组数据进行配对，产生了103对mRNA -蛋白质对，总体上显示出正相关。免疫亚组在总生存期和无复发生存期方面存在明显差异，其中IG1的预后最差，IG3的预后最好（图1B）。多变量Cox分析进一步验证了免疫亚群是一个显著的独立预后因素(图1C）。IG1有更多的肿瘤坏死和晚期肿瘤结节转移（TNM）阶段（图1D）。值得注意的是，淋巴结转移和血管侵袭在IG1中占优势，而内皮细胞在IG3中富集。在这个预后的TME特征中，IG1富含中性粒细胞脱颗粒和上皮-间质转化（EMT）的通路，表明有炎症和侵袭表型。相反，白细胞介导的细胞毒性和淋巴细胞介导的免疫通路在IG3中占主导地位，表明是一个免疫活性环境（图1A）。RNA-seq数据的xCell分析显示，IG1由髓系细胞如中性粒细胞和未成熟DC（iDC）主导，而IG3在适应性免疫细胞、自然杀伤（NK）细胞和活化DC（aDC）中含量丰富。IG2的免疫浸润相对较低且不均匀，伴随着基质细胞的稀少，这可能是肿瘤纯度最高的原因（图1D）。一般来说，中性粒细胞和iDC的丰富程度预示着生存率低，而淋巴细胞的积累，如CD4+T细胞、CD8+T效应/记忆（Tem）细胞和B细胞，与预后良好有关（图1E）。事实上，TIL估计值与肿瘤纯度呈负相关，与免疫反卷积呈正相关（图1F）。同样，TMA上的多重免疫染色证实，CD15、CD66b和CD1a的强度在IG1中最强，而CD3、CD8和CD20主要在IG3中表达（图1G和H），与xCell估计明显一致。

3个免疫亚群的分子特征不同

为了进一步说明患者亚组中的关键生物学过程，作者使用50个hallmark基因组进行了单样本基因组富集分析（GSEA）。结合转录组学和蛋白质组学数据的通路富集分析显示了免疫亚群之间不同的分子特征（图2A）。IG1在炎症反应、白细胞介素6（IL-6）/ JAK/ STAT3信号传导和TNF-α/ NF-κB信号传导中含量较高。IG2的特点是细胞周期转录程序（G2M检查点、E2F靶点、Myc靶点）和DNA修复通路的富集，显示了高增殖活性。IG3与糖酵解和缺氧通路的下调有关，也与氧化磷酸化（OXPHOS）通路的上调有关，这被强调为免疫激活的关键（图2A）。作者进一步关注促癌和抑癌的炎症。IG1富含原发性肿瘤炎症细胞因子和趋化因子，包括IL-1A, IL-1B, IL-6, CXCL3, CXCL5和CCL18（图2B）。大多数S100A家族成员的mRNA和蛋白水平，包括S100A8/A9，在IG1中被上调，这可能参与了癌症促进炎症的发生（图2C）。同时，CD8A、GZMA和PRF1的mRNA和蛋白水平的增加证实了IG3中抑癌性炎症的上调（图2B）。此外，一组免疫特征共同显示，相对于其他亚组，IG3显示出升高的T细胞生存和T效应特征，而IG1则表现出升高的骨髓源性抑制细胞（MDSC）、M2/M1巨噬细胞、骨髓炎和促炎症特征（图2D）。总的来说，这种分层确定了两个具有对抗性炎症表型的免疫亚群。

最近，环氧化酶2（COX-2）/前列腺素E2（PGE2）轴被报道参与调节泛癌研究中的对抗性炎症表型。作者发现编码COX-2的PTGS2的转录水平在IG1中明显上调（图2B，E），COX-2 mRNA水平较高的患者预后较差（图2F）。检测到COX-2 mRNA水平与促癌因子包括IL-1A、IL-1B和IL-6之间存在强烈的正相关关系（图2G）。中性粒细胞和iDCs的浸润与COX-2 mRNA水平呈正相关，而浆细胞、CD4+T细胞和CD8+Tem细胞呈负相关（图2H）。COX-2相关的炎症特征（COX-IS）是多种癌症对免疫检查点抑制剂（ immune checkpoint inhibitors，ICI）反应的预测因子，COX-IS从IG1到IG3依次下降。此外，IG3具有最高的细胞溶解分数和免疫分数（图H），进一步支持IG3可能更有可能对ICI作出反应的假设。

KRAS突变相关的髓系炎症在IG1中占主导地位

我们进一步调查了可能与免疫学特征有关的基因组改变。IG2有更频繁的体细胞拷贝数变异（SCNAs），SCNA负担与免疫细胞浸润负相关。当选择亚型特异性突变基因时，作者发现IG1中近一半的肿瘤是KRAS突变者（图3A，B）。KRAS突变与大多数xCell的适应性免疫和NK细胞特征呈负相关，但与iDC和中性粒细胞特征呈正相关（图3C）。mRNA和蛋白水平的GSEA分析都确定中性粒细胞脱颗粒是与KRAS突变最密切相关的通路（图3D）KRAS突变与一些炎症分子，如COX-2、IL-1A、IL-1B、IL-6和S100A8/A9明显正相关，类似于IG1的免疫学特征（图3E）。有KRAS突变的肿瘤也显示出骨髓炎症、COX-IS和MDSC特征的升高，以及细胞溶解特征的降低（图3F）。在Jusakul的队列中，KRAS突变也导致了中性粒细胞浸润、COX-2/S100A8表达和中性粒细胞脱颗粒通路的升高。考虑到PTGS2是IG1和KRAS突变肿瘤中与骨髓炎症相关的最明显的上调基因，作者假设KRAS突变可能上调COX-2产生PGE2，从而促进骨髓炎症。Transwell试验显示，与KRASWT相比，KRASG12D的培养上清液明显增强了中性粒细胞的迁移。KRASG12D培养液处理过的中性粒细胞显示出更强的免疫抑制活性。接下来，作者使用致癌驱动产生了iCCA小鼠模型（KRASWT (AY) or KRASG12D (AYK)）。免疫组化证实，AYK肿瘤明显浸润着中性粒细胞（Ly6G、S100A8和S100A9阳性），而没有CD8+T细胞和B细胞（图3G，H）。scRNA-seq分析显示，中性粒细胞和巨噬细胞在AYK肿瘤中的比例明显较高，而T/NK细胞、B细胞和基质细胞在AY肿瘤中更为丰富，与多组学的结果一致（图3I）。AYK肿瘤中的中性粒细胞显示出更高的骨髓炎症和炎症标志物如S100a8、S100a9、Ptgs2和Il1b的表达升高，同时伴随着T/NK细胞更强的衰竭表型（图3J）。值得注意的是，KRAS突变使COX-2在肿瘤细胞和微环境中的表达上调（图3G，H）。因此，中性粒细胞的过度浸润可能是KRAS突变相关的骨髓炎症的原因。总的来说，KRAS突变在颠覆抗肿瘤免疫和骨髓炎症相关的免疫抑制方面具有关键作用。

抗原呈递缺陷与IG2的免疫排斥相关

抗原呈递的缺陷可能中断新抗原的识别，导致肿瘤免疫逃避，而不考虑肿瘤突变负担（TMB）。因此，作者在三个免疫亚群中探讨了这些免疫逃逸途径的潜在作用（图4A）。尽管IG2的TMB和肿瘤新抗原负担（TNB）相对较高，但通过人类白细胞抗原的杂合性缺失（HLA LOH）或抗原呈递机制的其他成分的改变（APM），在IG2中经常观察到抗原呈递的缺陷（图4A、B）。这样的缺陷可能会阻碍新生T细胞的交叉刺激和随后被刺激的T细胞对肿瘤的识别，这可能解释了IG2中T细胞受体/B细胞受体（TCR/BCR）多样性和RNA-seq reads映射到VDJ位点的减少。作者进一步计算了每个肿瘤的免疫编辑分数（immunoediting score），通过量化预测的HLA-I类结合新抗原的观察数与预期数之比，分数<1表示存在免疫编辑。免疫编辑分数从IG1到IG3持续下降（图4C）。在每个免疫亚组中，只有HLA LOH的IG2肿瘤的免疫编辑得分明显较高，这表明IG2的肿瘤亚克隆可能容易出现HLA LOH相关的免疫规避（图4D）。总体而言，15%（n=38）的患者表现出HLA LOH，与HLA完整的患者相比，其总生存期和无复发生存期呈下降趋势（图4E，F）。

免疫检查点的表达可能反映了癌症对活跃免疫系统的适应性免疫反应。作者发现这些分子的亚组特异性模式。HLA LOH与一些免疫检查点分子相关，如程序性死亡配体1，并完善了TMB作为ICI的生物标志物。比较有HLA LOH和没有HLA LOH的肿瘤的多组学特征，发现HLA LOH富含较高的TMB/TNB，较高的肿瘤纯度，干扰素γ途径减少，主要组织相容性复合体I类特征减少。同样，在有HLA LOH的肿瘤中，T细胞生存和T效应特征也明显减少。因此，尽管IG2的TMB相对较高，但APM缺陷，特别是HLA LOH，可能涉及免疫过敏和之后的免疫排斥（图4G）。

三级淋巴结构（TLS）与IG3的抗肿瘤免疫相关

TLS为产生抗肿瘤免疫反应提供了一个关键的微环境。作者使用以前的TLS signature来估计TLS的分布，发现这些基因的mRNA水平，以及估计的TLS分数，在IG3中相对上调（图5A，B）。病理检查也证实，瘤内TLS在IG3中明显累积（图5C，D）。与那些只有聚合体（Agg）和没有TLSs（TLSs-）的患者相比，既有初级卵泡（FL-I）又有次级卵泡（FL-II）的患者具有更高的估计TLS评分，证实了TLS评分的准确性（图5E）。作者还发现瘤内TLSs预测的预后较好（图5F-H），TLSs+（Agg、FL-I和FL-II）患者的特点是TNM分期早，没有微血管侵袭，没有肝内转移，肿瘤体积小。多组学数据表明，TLSs+肿瘤显示了G2M检查点、炎症反应和EMT等通路的特异性下调，而代谢和过氧化物酶体的通路上调。T细胞和B细胞以及共抑制物在TLSs+肿瘤中富集，表明有免疫激活的表型。此外，细胞溶解分数和COX-IS都预示着TLSs+iCCA患者对免疫疗法有更好的反应。因此，IG3的免疫监视可能部分归因于瘤内TLSs（图5I），这预示着该亚组对免疫治疗有更好的反应。

HBV感染与iCCA髓系炎症呈负相关

乙肝病毒（HBV）感染是众所周知的iCCA的危险因素；然而，对HBV相关iCCA的免疫基因组学特征知之甚少。作者发现，HBV感染患者（n=68）在IG1中的代表性不足，与KRAS突变互斥，与TP53突变共存（图6A）。HBV阳性的肿瘤显示出细胞溶解评分升高，骨髓炎症特征降低，COX-2 mRNA水平下降（图6B）。最近的研究提出，ICI对HBV阳性肝细胞癌（HCC）患者显示出疗效，而不是非病毒性HCC。考虑到髓系炎症对免疫疗法的负面影响，COX-IS评分预测HBV阴性亚组对ICI的反应更差（图6B）。HBV阳性iCCA患者的转录组与其他对ICIs有反应的实体瘤的表达谱相似（图6C）。因此，在HBV阳性的iCCA中观察到的骨髓炎症的减少可能定义了一个可以从ICI中受益的人群。作者另外收集了5个HBV阳性和5个HBV阴性的iCCA的肿瘤和邻近的非肿瘤组织进行scRNA-seq分析。在HBV阳性的肿瘤中观察到T/B/NK细胞的比例增加，骨髓细胞的比例减少（图6D），但HBV感染并不影响相邻非肿瘤组织中每个集群的比例。接下来，作者对T/NK细胞和骨髓细胞进行了无监督的聚类。在T/NK细胞内共出现了13个聚类（图6E）。炎症性CD4 T_CD15442的比例在IG1中明显较高。CD4_SOCS343和NK_CD16044都在HBV阳性肿瘤中富集，这意味着HBV感染减轻了炎症反应并增强了细胞溶解活性（图6F）。髓系的重新聚类显示了14个种群（图6G）。值得注意的是，Macro_IL1B是HBV感染后比例下降最明显的髓系群，其特点是IL1A、IL1B、IL6和TNF的完全高表达（图6H）。COX-2 mRNA水平和促炎症特征在Macro_IL1B中明显高于其他骨髓细胞群，表明Macro_IL1B是骨髓炎症的主要来源（图6I）。来自HBV相关的iCCA的骨髓细胞显示了炎症通路的下调（图6J）。与HBV阴性样本相比，在HBV阳性样本中观察到的循环细胞的比例较小，反映出增殖能力相对下降（图6H）。总的来说，HBV阳性患者拥有独特的TME，CD4_SOCS3和NK_CD160群的比例增加，Macro_IL1B群和骨髓细胞增殖减少，这有助于抗肿瘤免疫。差异表达基因（DEG）分析显示，HBV阳性肿瘤的巨噬细胞中下调最多的基因包括CCL13、TSC、FCGR2A、C1QA和C1QB。HBV阳性肿瘤中的NK细胞上调了几个细胞溶解相关基因，如KLRC2、GZMK和CXCR6。在HBV阳性肿瘤中，巨噬细胞的特点是炎症反应下调，而NK细胞中的细胞毒性和异体移植排斥反应上调（图6K）。总之，iCCA中的HBV感染可能减轻骨髓炎症，促进抗肿瘤免疫。因此，HBV感染与较长的总生存期略有关联（图6L）。

总结

这项研究旨在确定可用于个体化治疗的iCCA免疫亚群的特征（图7）。作者通过综合多模态分析提供了对iCCA免疫景观的全面了解。具有免疫和非免疫特征的三个免疫亚群可能对设计使用iCCA的新治疗策略的临床试验有意义。

参考文献

Lin J, Dai Y, Sang C, Song G, Xiang B, Zhang M, Dong L, Xia X, Ma J, Shen X, Ji S, Zhang S, Wang M, Fang H, Zhang X, Wang X, Zhang B, Zhou J, Fan J, Zhou H, Gao D, Gao Q. Multimodule characterization of immune subgroups in intrahepatic cholangiocarcinoma reveals distinct therapeutic vulnerabilities. J Immunother Cancer. 2022 Jul;10(7):e004892. doi: 10.1136/jitc-2022-004892