WES和RNAseq联合分析晚期NSCLC患者免疫治疗疗效相关分子标志物

一、研究背景

PD1/PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3等免疫检查点抑制剂的开发将癌症治疗领入全新的免疫治疗时代，激活体内免疫系统杀伤肿瘤细胞取得很好治疗效果的同时，严重的治疗副作用（irAEs）、只有20%的获益人群比例和高昂的治疗费用，使得这种疗法难以大范围推广。如何筛选获益人群成为治疗的首要问题，很多分子标志物已被证实可以有效预测ICIs疗效，如PD-L1表达、TMB、TNB、发炎的肿瘤免疫微环境，特定癌种如结直肠癌中MSI不稳定性检测、MMR相关基因表达检测等。

二、结论

来自Broad Institute的科研人员，对SU2C-MARK队列393名经免疫检查点抑制剂一线治疗的晚期NSCLC患者，综合进行WES和RNAseq测序分析，结合临床治疗疗效(完全缓解/部分缓解 or 稳定 or 进展)评估分组，全面解析与积极应答和无反应的差异疗效相关分子标志物。研究发现，ATM变异显示有较好的响应率，而TERT扩增跟无应答相关；在转录组水平，免疫蛋白酶体的诱导组分(PSME1、PSME2、PSMB9)的表达与应答之间具有显著关联；一种肿瘤内在的去分化类型也显示出较好的应答率。

三、研究结果

1. 样本信息

本次研究共收集来自9个癌症研究中心共393名患者在免疫治疗前的FFPE样本，WES大多数采集的是肿瘤组织和配对血液对照，极少数采集的是癌旁组织对照，队列中其中一个亚组(n=152)进行了RNA测序。81%的患者经过PD1/PD-L1单药治疗，17%联合CTLA-4治疗，1%联合化疗，最佳总体缓解（BOR）情况经过专业的临床影像学技术人员评估，并通过RECIST v1.1量化分组为CR/PR、SD和PD。

病理结果显示，393名患者中，73%属于肺腺癌，20%属于肺鳞癌，2%为大细胞神经内分泌肺癌和4%的其它组织类型。PD-L1免疫组化结果发现，43%的患者缺乏PD-L1染色评估，成功染色的患者中25%的肿瘤比例评分（TPS）<1%，33%的TPS位于1%-49%，42%的患者PD-L1高表达，TPS>=50%。

2. 与疗效相关基因组特征

首先对患者WES数据进行全面的分子检测，包括点突变、indel、focal CNV、亚克隆、突变特征、HLA分型与LOH、新生抗原、TCR/BCR等。结果显示，TMB和主克隆突变负荷是最佳预测因子，另外TNB、新生抗原主克隆突变负荷、吸烟分子特征、特定indel分子特征对疗效也具有预测作用，可综合进行考量。

点突变检测结果显示，常见肺癌驱动基因变异均被检出，如TP53、KRAS/STK11共突变、CDKN2A、EFGR、ATM等。不同临床分组TMB差异明显，CR/PR组14.0 mut/MB，SD组9.0 mut/MB,PD组7.4 mut/MB。对49个经典的肺癌驱动变异跟临床分组进行logistic回归分析，其中ATM突变具有显著相关性（FDR q value=0.04,OR=3.5,95%CI=(1.5,8.0)），该结论在另外的MSK-IMPACT队列中也得到了验证。接下来的相关变异是EGFR(q value=0.12,OR=0.29,95%CI(0.11,0.79))。

对focal CNV检测结果同样进行logistic回归分析发现，5p15.33区带拷贝数变异跟疗效显著相关(q value=0.07,OR=0.59,95%CI(0.40,0.87)，其中包含TERT基因。

免疫逃逸相关B2M loss、HLALOH导致的HLA杂合位点减少在本队列中均没有发现疗效相关性，TCR burden具有相关性但不显著。

图1.WES分析结果

3. 与疗效相关转录组特征

表达分析与免疫微环境

按CR/PR和SD/PD患者分组进行差异表达分析，蛋白酶体诱导亚基PSME1、PSME2、PSMB9在CR/PR组中显著高表达，它们编码不同的蛋白酶体组分，受INFγ和TNF调控，可增强短肽的抗原呈递作用，从而提高响应率。同样高表达的还有炎性趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11及其淋巴细胞受体。β-catenin代谢通路相互作用转录因子AUTS2和TCF7L1、NK-kB通路负调节基因PDLIM3在SD/PD组显著高表达，跟免疫无应答有关。对Hallmark Gene Sets的 GSEA结果显示，较好应答与同种异体排斥、INFγ、DNA修复相关基因集显著富集有关，而EMT、Wntβ-catenin信号通路、TGF-β通路基因富集跟耐药有关。

使用先前鉴定的单细胞亚群表达特征，在RNAseq数据集上进行logistic回归分析，发现CD8+T细胞耗竭跟应答强相关，而单核/巨噬细胞、树突状细胞跟抗性强相关。另外使用已有的人和小鼠肺癌中浸润性骨髓细胞单细胞数据结果，在本队列中将hMono 3和hN 3亚型鉴定为与对检查点阻断的抗性特别相关。

图2. 转录组表达分析结果

NMF矩阵分解

对770个显著差异表达基因在患者中的表达矩阵进行B-NMF矩阵分解，得到3个不同的分子亚型M1、M2、M3，都代表包含免疫细胞和细胞基质表达的微环境综合特征。对三种不同的分子特征进行GSEA分析，发现M1跟EMT（伤口愈合和纤维化基因集）有关，M2跟同种异体排斥和IFNγ有关，M3跟细胞周期相关E2F靶点弱相关，可能反映了增殖性肿瘤特征，最类似之前报道的免疫沙漠表型，M2中应答率相比M1和M3有所增加，跟单细胞表达特征结论一致。

图3.NMF矩阵分解

肿瘤内在亚型(TI subytpe)

收集来自TCGA-LCNE具有明确病理分型的1000多名NSCLC患者的RNAseq数据，构建免疫应答显著相关基因以及免疫细胞和基质成分相关基因的表达矩阵，B-NMF将队列划分为明确的4个亚簇，其中TI-1和TI-2主要包含腺癌，TI-3主要包含鳞癌，TI-4代表大细胞神经内分泌癌。肺腺癌和肺鳞癌表达标志物NAPSA和TP63在分化良好的TI-2和TI-3中具有预期的谱系标记偏好，而在TI-1中均弱表达，肺谱系标志物的表达降低先前已在低分化腺癌的亚型中描述，低分化的TI-1中富集内胚层谱系标志物基因，如肠道谱系免疫组化标志物TFF1、FGA、CPS1的高表达。去分化的TI-I簇与应答最密切相关，这与该亚型中升高的突变负荷以及其与M2(免疫活化亚型)的更强相关性一致。

图4.肺癌病理亚型相关基因表达

4. WES和RNA分子特征综合分析

结合以上来自WES和RNA的多个最佳预测特征，通过相关性矩阵发现3个强相关模块,C1、C2和C3，且每个子模块内部特征具有一致的响应关联。C1反映典型的“伤口愈合”微环境，包括免疫抑制性骨髓和基质特征，C2反映与“免疫活化/耗竭”相关的更经典的细胞因子和免疫环境，包括浸润性免疫特征和蛋白酶体亚基，C3由与突变负荷相关的特征组成，代表新抗原丰度和增强的免疫识别，C4包含一些弱相关的分子特征，包括EGFR突变，但与中度突变负荷特征负相关，表明该亚型的内在抗性可能主要由较低的新抗原负荷相关。其中免疫活化/耗竭和伤口愈合簇相关特征的评估可增强患者PFS相关预测能力。

图5. WES和RNAseq预测因子相关性矩阵

5. 单细胞数据分析

对已发表的NSCLC单细胞RNA数据的综合细胞亚群分类结果，跟WES和RNAseq结合最佳预测因子特征进行关联分析，发现cluster12对TI-1中去分化肺腺癌亚群的重现，TI-1中代表伤口愈合和免疫激活/耗竭分子特征相关的EMT和TGF-β主要反映成纤维细胞和内皮细胞，而不是间充质细胞，负预测因子AUTS2和TCF7L1在肿瘤内低表达，蛋白酶体在大部分细胞中表达，炎性趋化因子CXCL9可能来自于髓系细胞，CXCL11可能来自于内皮细胞。低分化TI-1跟M2特征虽然具有强相关性，但在单细胞分析结果中显示包含不同的细胞亚群，提示我们较大的相互关联块在单细胞中并不总是代表相同的细胞来源。

图6. 单细胞分析结果

6. 总结

本文首次对将近400例NSCLC患者免疫治疗相关生物标志物进行全方面分析，深入剖析免疫检查点抑制剂响应与耐药分子机制。包括基因组水平变异（ATM突变、TERT扩增）、转录组水平表达（蛋白酶体诱导组分基因）、微环境分子特征(M1：伤口愈合，EMT和TGF-β基因富集；M2：免疫活化；M3：免疫沙漠)、肺癌病例亚型分子特征（TI-1：去分化肺腺癌，TI-2主要包含腺癌，TI-3主要包含鳞癌，TI-4代表大细胞神经内分泌癌），以及对所有预测因子根据相关性聚合成C1、C2、C3、C4模块，同时在肺癌单细胞RNA数据中深入发现以上关联块所代表的细胞亚群。