泛癌单细胞分析癌症相关成纤维细胞的异质性和可塑性

大家好呀，今天小编给大家带来的是本月最新发表在nature communications上的一篇文献，题目是“Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment”（IF：17.694）。

癌症相关成纤维细胞(CAF)是肿瘤微环境(TME)的主要成分，影响肿瘤标志物，但尚未对其在不同癌症类型中的普遍特征进行系统研究。作者对10种实体瘤的226个样本进行泛癌分析，以单细胞分辨率描述TME，说明异质性CAF的共性/可塑性。

主要结果：

• 主要CAF类型的激活轨迹分为三种状态，与其他细胞表现出明显的相互作用，并与免疫治疗的预后有关。次要的CAF类型来源于其他TME成分(如内皮细胞和巨噬细胞) 。
• 广泛存在的内皮-间充质转变CAF，可能与SPP1⁺肿瘤相关巨噬细胞相互作用，与内皮-间充质转变和生存分层有关。

背景：

TME中存在不同类型的非恶性细胞，主要包括成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞。以前的研究已经强调了TME在癌症中不可或缺的作用，如肿瘤进展、治疗耐药、血管生成诱导和转移。从机制上讲，TME通过复杂和动态的途径调节与癌症相关的信号，涉及配体-受体相互作用、细胞因子/代谢物反应和细胞外基质沉积。

由于不同癌症类型患者的TME细胞相似，最近进行了一些基于scRNA-seq的泛癌研究，这些泛癌研究只关注免疫细胞的特性，而忽略了不同细胞成分之间的相互作用。

结果：

Results1：Landscape of the TME in pan-cancer illustrated using scRNA-seq analysis

非监督聚类产生了总共34个与TME相关的簇。根据不同细胞类型的marker，这些簇被分为五个主要细胞成分，包括成纤维细胞(c1-c8，DCN，COL1A1)，淋巴细胞(c9-c17，CD3D，CD3E)，髓系细胞(c18-c24，CD68，CD14)，内皮细胞(c25-c28，VWF，PECAM1)和浆细胞(c29-c34，IGHG1，JCHAIN)。其余的细胞聚集为上皮细胞(EpCAM，KRT19)（图1 a-c）。

与上皮癌细胞的组织类型特异性分布相比，不论癌症类型还是组织类型，TME均无明显偏倚。虽然五种TME组分在正常组织、邻近组织和肿瘤组织中分布相对均匀，但来自癌症/邻近组织的细胞主要集中在特定的簇中(例如，c2和c9)，反之亦然(例如，c3)（图1 d-e）。

C20(FABP4+巨噬细胞)，显示出癌症类型的丰富。与邻近对照、早期和晚期原发肿瘤以及肺癌脑转移相比较FABP4+巨噬细胞(c20)的比例逐步下降，提示FABP4+巨噬细胞可能与肺癌进展呈负相关。APOE+肿瘤相关巨噬细胞(TAM, c19)的异质性通过C1QC+和SPP1+细胞的互补分布表现出来。在不同肿瘤类型中，SPP1+ TAMs的比例从正常到邻近/肿瘤样本显著增加，而SPP1-TAMs的比例不显著增加，提示SPP1+ TAMs在肿瘤发生和代谢中的潜在作用。 （图1 f-i）

肿瘤内皮细胞(TECs)和正常内皮细胞(NECs)的不同转录谱，包括TEC显著上调胰岛素反应相关基因(IGFBPs和INSR)、MAPK调控基因(如SPRY1)和免疫球蛋白(如CD320和IGHG4) ，这表明TECs可能在血管生成、肿瘤生长和免疫调节中发挥作用。（图1 j）

Results2：Generalized activation of CAFs in the TME

CellphoneDB评估每个主要TME组分与上皮细胞之间的相互作用。总体交互作用按正常、邻近和肿瘤的顺序显著增加。成纤维细胞、内皮细胞和髓系细胞之间的串扰在TME中占主导地位。肿瘤/邻近样本中，成纤维细胞与其他TME组分的串扰最频繁，成纤维细胞可能通过与其他TME组分相互作用，在癌症生物学过程中发挥重要作用。（图2 a-c）

通过分别过度表达ACTA2、FAP/TGFB1和CFD，将三个数量占主导地位的主要成分(即c1、c2和c4)定义为癌症相关肌成纤维细胞(CAFmyo)、炎性CAF(CAFinfla)和脂肪源性CAF(CAFadi)。

其他三个次要成分(即C6-C8)被鉴定为内皮细胞到间充质转化CAF(CAFEndMT)、外周神经样CAF(CAFPN)和抗原提呈CAF(CAFap)。SCENIC分析确定了CAFmyo、CAFinfla和CAFadi中可能存在的调节子。（图2 d,e）

通过进化轨迹揭示了从NFS到CAF的两条不同的激活路径，增强了三种不同状态的定义，CAFstate1(NFS)、CAFstate2(CAFmyo)和CAFstate3(CAFadi/CAFinfla)。EMT评分沿着CAF的激活轨迹逐渐增加，且CAFstate3显著高于CAFstate1/2，提示在CAF激活过程中存在一个普遍的去分化过程。CAFstate2倾向于在血管生成中发挥作用，而CAFstate3同时高表达促血管生成基因和免疫调节相关基因。（图2 f-h）

Results3：Interactions of CAFs with TME and epithelia

CAF_state3与NK/T亚簇之间的相互作用高于CAF_state1和CAF_state2。除了获得性免疫外，CAF还可能调节先天性免疫细胞。TAM与CAF_Status3存在较多的受体配体对，而肥大细胞几乎不与CAF相互作用。TECs与CAF_state2/3之间的相互作用比较强烈（图3 a-f）

CAFstate3与免疫细胞之间的联系最为紧密，CAF状态可能在检查点阻断免疫治疗中发挥重要作用。基于ssGSEA，使用三个独立免疫治疗数据的患者的bulk数据来估计每个State CAF的比例。CAFstate3的高比例与较差的总体生存率显著相关，提示CAFstate3在免疫治疗中具有潜在的独立预后价值。（图3 g）

Results4：Characterization of the plasticity of fibroblasts via pan-cancer analysis

CAF_ap高表达ACTA2、HLA-DRA和CD74。CAF_ap与肿瘤浸润性T细胞的相互作用明显多于CAF_myo。

CAF_ap可能是CAFs和TAMs之间的过渡位置。伪时序分析，显示了一条可能的进化TAM-CAFap-CAFmyo路径。过共聚焦mif成像在甲状腺癌的间质中发现了少量共表达α-sma和CD163的细胞。CAF(Mylk)和TAM特异的调节子(MAFB和SPI1)沿TAM-CAFap-CAFmyo轨迹逐渐丰富，CAFap存在于这两个调节子中（图4 a-f）。

外周神经样CAF(CAF_PN) ，特异性表达周围神经相关基因（ MPZ, S100B, LGI4, PLP1 ）。此外， CAFPN在调节外周神经髓鞘形成过程中增加了独特的转录调控因子(SOX2和SOX10) ，具有明显的代谢特征（图4 g）。

CAF_EndMT显示了成纤维细胞和内皮细胞marker的双重表达。并且，与正常组织相比，肿瘤组织种CAF_EndMT与其他细胞簇的通讯更强。CAF_EndMT处于从TEC到CAF_myo的过渡位置。

血管生成signature在CAF_EndMT中高度丰富。CAF_EndMT倾向于参与细胞迁移和血管发育途径。

基于ssGSEA从TCGA队列中估计了每个患者的CAF_EndMT打分。CAF_EndMT的高比例与几种癌症类型的预后不良有关（图5）。

Results5：The triple interplay between CAFs, TECs, and TAMs in the TME

根据NicheNet分析估计，CD44在CAF_EndMT和TAM之间的相互作用计数方面排名第一，SPP1和APOE在所有受体配体对中在TAM中的表达最高。在肿瘤样本中发现CAF_EndMT与SPP1+TAMS的相互作用多于与SPP1-TAMS的相互作用。在SPP1+TAMS与CAF_EndMT之间的相互作用中，富含SPP1_CD44。CD44的表达沿着EndMT的轨迹逐步增加，这一结果表明SPP1_CD44相互作用可能参与了EndMT过程（图6 a-d）。

三种癌症类型中，mIF表明一些SPP1+ TAMs (SPP1+CD68+)接近于CAF_EndMT(CD44+CD31+)。表型图像和密度图分别用于量化标记的表达和空间分布。排除缺陷区域后，定量分析CAF_EndMT细胞的空间密度分布，并将其分为高密度区(HDA)和低密度区(LDA)，与LDA相比，HDA中SPP1+ TAMs明显富集。此外，在量化空间分布时，我们发现在CAF_EndMT20μm内SPP1+ TAM比值显著高于20μm外。在7例结直肠肿瘤标本的空间转录谱中，CAF_EndMT和SPP1+TAMs的signature富集之间存在显著的相关性。

总结：

本文对多种癌症类型的单细胞图谱进行了研究，对不同癌症类型的成纤维细胞的单细胞转录图谱的系统研究揭示了癌症和间质细胞的异质性和癌症生物学特征。大多数CAFs可能来自于局部正常成纤维细胞的激活。小部分CAFs来自内皮细胞、周围神经和巨噬细胞。CAF_state3处于最去分化的状态，与免疫细胞相互作用，预测免疫治疗较差。因此，CAF分化可能促进免疫治疗患者的分层。SPP1⁺ TAMs可能通过与邻近的CAF_EndMT相互作用参与肿瘤血管生成，导致癌症不良预后。