Nature子刊：肺癌患者肠道念珠菌过度生长或与乳酸有关！

人体中的微生物有三大势力，病毒、细菌、真菌。念珠菌在人体肠道中过度生长被认为是侵袭性念珠菌病的先决条件，肠道细菌群究竟是促进还是限制念珠菌的过度生长，仍需进一步探究。近日，Nature Communications杂志（IF：17.69）发表重磅研究《Candida expansion in the gut of lung cancer patients associates with an ecological signature that supports growth under dysbiotic conditions》，揭示肺癌患者肠道念珠菌过度生长或与乳酸有关！

本文亮点

1）纳入75名无全身性念珠菌感染的晚期肺癌患者，收集其粪便，进行宏基因组和ITS测序，发现无感染肺癌患者念珠菌水平显示出较高变异性；

2）根据念菌株属的CLR丰度可将患者分为为两组：高念珠菌组(HC，n = 38)和低念珠菌(LC，n = 37)；相比低念珠菌组，高念珠菌组菌群具有更高代谢灵活性和更低贡献多样性；

3）开发出机器学习模型，使用细菌分类或功能相对丰度可预测外部验证队列中念珠菌水平；

4）肠道念珠菌过度增长与产乳酸细菌增加、产短链脂肪酸和需氧细菌减少有关，念珠菌可利用乳酸作为营养来源促使其与肠道中其他真菌竞争。

数据来源

作者在来自匈牙利的2所肺病医院（国立科兰尼肺病研究所和特勒克巴林特肺病医院）共招募了75名晚期肺癌患者，这些患者入组之前没有任何真菌感染的证据。在单药抗PD -1抗体免疫治疗开始后(纳武利尤单抗，n = 44；帕博利珠单抗，n = 31)，收集患者粪便样本，分别进行宏基因组分析（Metagenome）和真菌组分析（Mycobiome）。

【题外话】简单介绍几个生物学概念：

①Microbiota（微生物群）：指研究动植物体上共生或病理的微生物生态群体。微生物群包括细菌、古菌、原生动物、真菌和病毒。

②Microbiome（微生物组）：是指除了研究微生物群体本身（细菌、古菌、原生动物、真菌和病毒）外，还研究其基因组。本文中提到的“Mycobiome”即指对微生物群中的真菌及其基因组进行分析，以下称“真菌组”。

③Metagenome（宏基因组）：指直接研究环境样品作为遗传学材料，广义来说其包括环境基因组、生态基因组学和群体基因组学。

④OUT，全称为Operational Taxonomic Unit，在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。通常按照 97% 的相似性阈值将序列划分为不同的 OTU，每一个 OTU 通常被视为一个微生物物种。相似性小于97%就可以认为属于不同的种（Species），相似性小于93%-95%，可以认为属于不同的属（Genus）。样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度都是基于对OTU的分析。

温馨提示：本文中还出现了很多其他的生物学概念和分析算法，小编不在这里一一赘述，如果有不明白的名词，鼓励各位小主自行查阅资料进行学习了解，当然，您也可以在评论区留言，如若有需要，小编会单独再写篇推文介绍相关概念。

结果解读

1.无真菌感染肺癌患者中念珠菌水平的高度变异性

收集患者粪便进行真菌组分析，共获得了76个真菌属和113个真菌种(图1a)，其中Candida（念珠菌属）和Saccharomyces（酵母菌属）是丰度最高的真菌属(图1b)，冗余分析(dbRDA)显示，二者也是真菌群落多样性变化的主要驱动因素(图1c)。通过PCoA主坐标分析患者的年龄、性别、体重指数(BMI)、饮食习惯和抗生素使用情况对菌落多样性的影响，发现抗癌治疗前(粪便取样前60天)使用抗生素治疗与菌群排序结果显著相关，暗示了抗生素对肠道菌群的影响(图1e)。

作者对不同的真菌属进行归一化分析，发现念珠菌属的归一化丰度之间存在高度相关性，根据念珠菌属的CLR丰度中位数，将患者分为两组：高念珠菌组(HC，n = 38；平均TSS = 33.4%)和低念珠菌组(LC ，n = 37；平均TSS = 0.6%)。这种高和低念珠菌分组与内转录间隔区（ITS）读数显著相关（图1f），但与ITS总拷贝数无关（图1g)，说明测序深度不影响分组。通过PCoA分析发现，HC组和LC组之间的β多样性有显著差异(图1h)，但没有观察到α多样性的显著差异。

接下来，作者对用于真菌组分析的相同粪便样本进行了宏基因组测序分析，重点关注细菌群落，特别是分类和功能特征，这可能是支持不同念珠菌种在人类肠道中生长的关键。评估了234个细菌种，84个细菌属，394个MetaCyc途径，1688种酶，5120个KEGG Orthology条目，155种KEGG途径和1427个病毒OTU（vOTU）的相对丰度(图1a)。为了确保在进一步的分析中只获得细菌信息，作者使用HUMAnN2工具删除了未知或非细菌来源的特征。分析显示真菌和细菌物种的β多样性之间存在显著的相关性。细菌物种解释了大约13%的真菌物种多样性，使用细菌物种的dbRDA分析表明梭状芽孢杆菌、乳杆菌、真杆菌和柠檬酸杆菌物种对真菌群落变异的解释能力最高（图1d）。有趣的是，细菌物种丰度与真菌物种多样性的双图表明，念珠菌属丰度与几种乳杆菌种呈正相关（图1e）。

2.与高念珠菌组相关的细菌和噬菌体特征

HC和LC组的细菌群落和功能β多样性具有显著差异，这可能是由细菌群落的功能特性(MetaCyc, KOs和ECs)引起的，因为其存在了最大的组间差异（图2a-c），但HC组和LC组的细菌群落α多样性(Shannon、Simpson、Pilou’s even和Chao1指数)无显著差异。令人惊讶的是，与LC组相比，MetaCyc途径在HC组中表现出更高的α多样性（图2e），但相比之下，HC组的细菌群落对MetaCyc途径多样性（Simpson多样性）的贡献显著降低（图2g-f），总之，这些发现表明，HC组的细菌群落具有更大的代谢灵活性，但与LC组相比，覆盖相同代谢功能的微生物群落水平降低，表明HC微生物群不那么强健。

接下来，作者根据细菌对氧气的耐受性对其进行分层。研究发现，HC组中的专性厌氧菌丰度明显低于LC组(图2h)， 但兼性厌氧菌丰度高于LC组(图2i)。在一个27例重症监护病房(ICU)患者的独立队列（队列#2）中，厌氧菌和白色念珠菌（C. albicans）呈负相关，与此一致，厌氧菌的丰度与念珠菌CLR丰度呈负相关。 此外，有项研究对15名同种异体造血细胞移植患者（包括8名念珠菌感染和7名对照者）粪便和血液进行测分析发现，念珠菌属的扩增与厌氧菌多样性的显著丧失有关。之前对小鼠进行的一项研究，发现念珠菌属定植增加与抗生素治疗引起的厌氧菌较少有关。因此，可以推测，HC组中需氧菌的增加及其有氧呼吸可能是所观察到的代谢多样性增加的原因(图2e)。对多样性产生逆转录因子(DGRs)的进一步研究显示，HC组中DGRs噬菌体基因显著减少(图2j)。DGR元件利用易出错的逆转录酶在其宿主的特定靶基因上诱导随机突变进入基因组，从而产生群体范围内的高变异性，由于DGR其目标宿主具有有益作用(例如，适应性优势)，因此这些噬菌体中的富集可能意味着LC组中存在更强健的细菌群体。

3.乳酸菌和产SCFA菌的丰度可准确预测念珠菌水平

作者进行了监督机器学习(ML)，评估是否可以仅根据细菌种类或功能相对丰度将患者识别为HC组或LC组。使用SIAMCAT构建模型，对默认算法采取数据增强训练，在11名接受免疫治疗的肺癌患者队列中验证模型。在验证队列中，HC和LC使用与测试队列相同的丰度阈值来定义。结果显示，细菌种类丰度可以将患者分为HC或LC准确率很高(图3a，[CV auROC] = 77.9%)和验证队列(图3a，auROC = 78.6%)。对于细菌功能丰度(通过EC)，获得了更高的准确性(图3a;CV auROC = 80.4%；验证队列auROC = 82.1%)。

作者进一步研究了是否可以预测C. albicans（白色念珠菌）, C. sake（清酒念珠菌）和 C.glabrata（光滑念珠菌）的丰度水平，这3种念珠菌中是最普遍和最丰富的念珠菌物种。类似于HC组和LC组分组方法，根据每个菌种的平均CLR丰度将其分为高丰度组和低丰度组，并建立ML模型。结果显示，鉴定出的微生物组特征可以很好地将患者分为对应的高丰度或低丰度组，测试队列(图3a，CV auROC：白念珠菌= 77.5%，清念珠菌:77.0%，光念珠菌：73.9%)和验证队列(图3a，auROC：白色念珠菌= 86.7%，清酒念珠菌：86.7%，光念珠菌:79.2%)。

有趣的是，测试队列中噬菌体vOTU丰度显示出预测念珠菌丰度的潜力(图3b，CV auROC：73%±1%)，但在验证队列中潜力较小(图3b，auROC: 53-75%)。在单独使用噬菌体组成的测试和验证队列中(auROC = 73%)，白色念珠菌丰度都得到了可靠的预测。提示噬菌体可能通过影响肠道微生物群间接影响念珠菌丰度，最近也有证据表明某些噬菌体直接抑制白色念珠菌。

作者进一步分析发现，许多细菌种类对LC的预测具有较高的稳健性（图3c），发现了很多产生短链脂肪酸（SCFAs）的细菌，包括Bifidobacterium adolescentis，Eubacterium rectale， Anaerotruncus colihominis， Alistipes ihumii AP11，Lachnospiraceae species，Pseudoflavonifractor capillosus和Odoribacter splanchnicus等。此外，作者监测了这些细菌产生SCFAs的可能性，并证实LC组中富含的许多细菌种类至少可以分泌醋酸盐、丙酸盐或丁酸盐中的一种。SCFAs在抑制白色念珠菌生长中的重要性已被多次报道，然而，SCFAs的抑制功能似乎在所有念珠菌中普遍存在。丙酸盐和丁酸盐抑制念珠菌定植的几种机制已被提出，包括调节免疫系统或直接抑制。SCFAs对氧气有效性也有重大影响，因此，在HC组中产SCFAs细菌的减少可能伴随着兼性需氧菌的增加，于是作者测量了一部分患者尿液中的SCFAs，发现专性厌氧菌丰度与丁酸盐呈显著正相关。此外，HC组中存在耐氧菌的富集(图3c)。有趣的是，HC组中有几种乳酸菌明显增加，并且在ML模型中一直被选为顶级特征(例如，Lactobacillus gasseri和Lactococcus lactis)(图3c)。

通过分析MetaCyc途径丰度来检测细菌的代谢功能(图3d)，HC中有78条通路丰富，LC中只有11条通路丰富。HC组富集的途径之一是从己醇中产生乳酸(P461-PWY)。与厌氧菌减少的观察结果一致，HC组好氧细菌的有氧呼吸(脂肪酸和β氧化途径、TCA旁路、TCA循环II)和细胞膜化合物合成途径(甲基萘酚和泛醌合成)增加。值得注意的是，通过将p值略微放宽至0.07，获得了HC组中另外5条丰度更高的TCA循环途径(专性自养生物中的TCA循环I、IV、V、VII和部分TCA循环)，有效覆盖了MetaCyc数据库中9条TCA途径中的6条(图3d)，基因集富集分析证实HC组有氧呼吸水平升高。

基于产乳酸细菌的丰度增加，作者研究了与乳酸利用相关的功能，发现HC组的

D-乳酸脱氢酶(D-LDH)家族显著增加(3e)。通过宏基因组代谢分析来预测整个细菌群落的代谢通量，发现HC组的D-乳酸分泌比LC组增加，但没有达到统计学意义(P = 0.051，图3 f)。对部分患者尿液乳酸水平进行测试发现，乳酸水平与白色念珠菌呈显著正相关，与念珠菌属丰度成正相关。此外，在队列#2中，血清乳酸水平与白色念珠菌丰度正相关。

总之，本研究确定了一个独特的肠道微生物特征，预测无感染肺癌患者念珠菌属的丰度，这描述了肠道菌群失调状态，其特征是产SCFAs细菌的系统性减少和耐氧微生物(包括某些乳酸菌)的增加。

4.白色念珠菌（C. albicans）在利用乳酸方面胜过酿酒葡萄球菌（S. cerevisiae）

数据表明，微生物产生乳酸、高分子氧可用性和肠道中念珠菌物种数量的增加之间可能存在联系。为了验证念珠菌种类可能超过其他真菌的假设，作者首先尝试使用具有高ITS2相对丰度的样本（>50%念珠菌reads），从7名ICU患者的粪便（队列#2）中分离出念珠菌菌株，共获得了7个活菌分离株，其中有4株白色念珠菌被用于进一步的实验。在本研究研究队列中，酵母菌是白色念珠菌的主要竞争对手，作者选择了一株能够在体内定植人类的人相关酿酒酵母菌株（YJM128）进行后续的实验。

首先，作者对所有菌株在不同碳源（葡萄糖或乳酸+葡萄糖[Glu + Lac]）和不同氧水平（微氧或有氧）上进行了个体体外生长实验(图4a）。在有氧（正常氧）条件下，与单一葡萄糖相比，菌株在Glu + Lac培养基中的指数阶段生长速率均显著降低。在微好氧条件下，两株白色念珠菌菌株在碳源之间没有显著差异。为了评估念珠菌和酵母菌种类之间的直接竞争，将每个白色念珠菌分离物与酿酒酵母共培养（图4b）。与酿酒酵母菌株YJM128相比，有氧条件下，在Glu + Lac培养基中白色念珠菌占据明显优势；微需氧条件下，4株白色念珠菌菌株中的3种占据明显优势。此外，白色念珠菌在Glu + Lac培养基中的生长优势略高于单一葡萄糖培养（图4b）。

总的来说，作者发现白色念珠菌在体外常氧条件下利用乳酸方面比酿酒酵母具有生长优势。尽管在下消化道可能会出现较高氧水平的微生态位，但微有氧条件下的结果更能代表这两种酵母在人类肠道中的真正竞争环境。在这种情况下，3株白色念珠菌在使用Glu + Lac培养基时，与仅使用葡萄糖相比，比酿酒酵母YLM128具有更强的生长优势。

总结

作者通过宏基因组学数据和体外竞争实验揭示了与念珠菌水平相关的强大细菌组特征。即在低氧条件下，由于SCFAs产生菌的减少，念珠菌可将肠道中额外的乳酸作为碳源而获得竞争优势，这一发现非常值得进一步关注。但是，我们不得不承认，人体肠道是个高度复杂的环境，包含成千上万种微生物菌群，免疫系统、微生物、肿瘤三者是又是相互塑造的，体外实验很难模拟肿瘤患者真实肠道情况，想彻底弄清肺癌患者肠道念珠菌过度生长与乳酸的关系，任重而道远！

参考文献：

Seelbinder B，et al. Candida expansion in the gut of lung cancer patients associates with an ecological signature that supports growth under dysbiotic conditions. Nat Commun. 2023 May 9;14(1):2673. doi: 10.1038/s41467-023-38058-8. PMID: 37160893; PMCID: PMC10169812.