大家好呀，今天分享的文章题为通过对多种癌症的单细胞数据分析揭示了肿瘤和正常组织之间的内皮细胞的差异，于今年一月发表在《Computational and Structural Biotechnology Journal》（IF = 6.155）上，文章整合了6种癌症的单细胞数据，让我们一起学习一下吧！

一、摘要

内皮细胞（ECs）在肿瘤进展中起着重要作用。目前，抗血管生成治疗的主要靶点是血管内皮生长因子（VEGF）通路。抗VEGF/VEGFR治疗由于其对正常EC的作用，可能导致肾毒性和心血管相关的副作用。因此，有必要识别肿瘤EC特异性靶点，可应用于各种癌症类型。本文整合了来自6种癌症类型的scRNA-seq数据，构建了一个多癌症EC图谱来解析肿瘤EC的特征。发现尖状EC主要存在于肿瘤组织中，而很少存在于正常组织中。尖状EC参与促进肿瘤血管生成和抑制抗肿瘤免疫反应。此外，肿瘤细胞、髓系细胞和周细胞是促血管生成因子的主要来源。在多种癌症类型中，尖状EC的高比例与不良预后相关。还发现了PSMA是非前列腺癌中尖端样ECs的特异性标记物（流程图：图1）。

二、结果

1、多种癌细胞图谱的构建

本文收集了6种癌症类型的scRNA-seq数据，包括结直肠癌（CRC）、胃癌（GC）、肺癌LC、卵巢癌（OVC）、胰腺导管腺癌（PDAC）和肾细胞癌（RCC），对获得的数据进行单细胞分析构建多癌细胞图谱，其中包括来自83个肿瘤样本和30个正常组织的220075个细胞，对其进行去批次和质量控制。根据标记基因将细胞分为13个不同的细胞簇：B细胞、浆细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、树突状细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、NK细胞和周细胞（图2）。

2、对scRNA-seq和bulk RNA-seq数据的综合分析揭示了肿瘤组织和正常组织之间EC组成的差异

作者从整合好的多癌症细胞图谱中提取EC，一共10277个ECs，并将其重新划分为6个细胞亚群：动脉内皮细胞、静脉内皮细胞、毛细血管ECs 1、毛细血管ECs 2、尖状EC、淋巴EC。毛细血管ECs 1存在于各种组织中，而毛细血管ECs 2主要存在于肾脏中，可能是一种组织特异性的EC亚簇(图3d)。在研究的所有癌症类型中，尖状EC主要存在于肿瘤组织中，而在正常组织中几乎不存在。其他EC亚群在肿瘤组织和正常组织中不存在差异。

作者利用构建的多种癌症单细胞图谱作为背景基因集，使用CIBERSORTx算法对TCGA进行反褶积计算。为了检验反褶积计算的尖状EC比例的准确性，分析了尖状EC基因特征的富集评分与多种癌症类型中尖状EC比例之间的相关性，发现基因特征与尖状EC比例呈正相关，表明尖状EC比例的预测是基于尖状EC中特异性基因表达。结果还显示，在大多数癌症类型中，肿瘤组织中尖状EC的比例明显高于正常组织，这与多癌scRNA-seq数据的结果一致。同样，包括动脉EC、静脉EC和淋巴EC等三个EC簇的比例，在多种癌症类型的肿瘤组织和正常组织中也没有差异。有趣的是，COAD、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、THCA等7种肿瘤中总ECs的比例均高于正常组织，这表明这些肿瘤组织中的血管生成更为活跃（图3）。

3、尖状EC代表一种活化的EC亚簇，可以促进肿瘤血管生成同时抑制抗肿瘤免疫反应

作者研究了尖状ECs的分子特征，GSVA分析显示尖状ECs在Notch信号、Wnt/β-连环蛋白信号、血管生成和蛋白分泌通路富集。表明尖状ECs代表了一个活化的EC亚簇，促进肿瘤血管生成。毛细血管ECs 2在炎症相关通路中富集，如炎症反应和TNF-α信号通路。相比之下，毛细血管ECS 1可能处于静息状态。使用GSVA对尖状ECs进行GO分析，发现参与钙粘蛋白介导的细胞粘附负调控的基因集富集，表明尖状ECs可能通过诱导血管通透性促进肿瘤细胞的生长。

本文通过细胞通讯分析研究尖状ECs如何影响TME，在本研究的六种癌症类型中，MIF-CD74在尖状ECs和免疫细胞之间高度富集。最近的研究表明，MIF-CD74可以通过招募肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）或直接抑制T细胞活化来抑制抗肿瘤免疫反应。因此，尖状ECs可能通过与多种免疫细胞的作用来抑制抗肿瘤免疫反应。在多种癌症类型中，尖状ECs与CD8⁺ T细胞之间呈显著负相关，表明尖端样ECs可能抑制CD8⁺ T细胞的浸润。总之，尖状ECs代表了一个活化的EC亚簇，它可能促进肿瘤血管生成，同时抑制抗肿瘤免疫反应（图4）。

4、肿瘤细胞、基质细胞和髓系细胞是促血管生成因子的主要来源

TME具有高水平的促血管生成因子，如VEGF、胎盘生长因子（PlGF，由PGF编码）、血小板源性生长因子（PDGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）。因此，作者进行了细胞通信分析来确定这些促血管生成因子的来源。结果显示，肿瘤细胞、成纤维细胞、髓系细胞和周细胞均可分泌VEGFA或PlGF。进一步分析显示，肿瘤细胞和髓系细胞，包括巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞和树突状细胞，是VEGFA的主要来源，而周细胞是PlGF的主要来源（图5）。

6、在多种癌症类型中尖状ECs的高比例与临床结果较差相关

为了进一步评估尖状ECs比例与患者总生存期的相关性，根据TCGA数据库中不同癌症类型的患者按尖状ECs比例（高或低）分为两组进行生存分析。结果显示，较高的尖状ECs比例相关在LUAD、OV、STAD、CESC、KIRP、BLCA和UCEC等多个癌症队列中，临床结果较差。(图6)

6、 PSMA是非前列腺癌中尖状ECs的特异性标记物

以上结果表明，尖状ECs在肿瘤进展中发挥重要作用，可作为癌症治疗的潜在靶点。为了确保精确的靶向，作者系统地评估了尖状ECs中的特异性膜标记物。CXCR4是尖状ECs的常用标记物，其在尖状ECs中的表达量高于其它EC亚群。然而，CXCR4在大多数免疫细胞中也有表达，因此它不是尖状ECs的理想标记物。为了识别出针对尖状ECs的更特异性的膜标记物，本文筛选了所有的膜分子。首先，筛选了在尖状ECs中高表达的基因，然后通过查询数据库来选择膜分子。结果表明，其含量特别高在尖状ECs中表达的膜分子包括CA2、INSR、HTRA1、MCAM、CDH13、PLVAP、THY1、TNFRSF4、LAMA4、PXDN、FOLH1和EDNRB。比较它们在不同EC亚簇中的表达，发现FOLH1是唯一在尖状ECs和其它EC亚簇中差异表达的。此外，只有不到5%的上皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞和周细胞有FOLH1的表达。因此，本文提出前列腺特异性膜抗原（PSMA，FOLH1编码）可以作为尖状ECs的特异性标记物和治疗靶点（图7）。

三、小结

作者是如何整合6套癌症单细胞数据的呢？

1、我们通过HGNChelper包更新了所有scRNA-Seq基因表达矩阵的基因符号。

2、使用Seurat中单个癌症类型的基因表达矩阵生成了六个Seurat对象（过滤：排除少于200个基因的细胞，超过8000个基因的细胞，超过25%的线粒体基因和超过1%的hemoglobin基因的细胞）

3、将所有的Seurat对象合并，构造一个组合的Seurat对象。合并后的Seurat对象进行NormalizeData、ScaleData、Find Variable Features（选了2000个）和RUNPCA处理，接下来使用Harmony软件包的RunHarmony函数对不同样本的Seurat OB进行集成，并校正批处理效应。

4、使用Find Neighbors 和 Find Clusters函数在分辨率为3的情况下进行聚类，使用50个主成分进行分析并应用UMAP对细胞图谱进行可视化。

本文整合了多种癌症的数据，提取其中的EC细胞亚群进行研究，发现尖状EC主要存在于肿瘤组织中，而很少存在于正常组织中。尖状EC参与促进肿瘤血管生成和抑制抗肿瘤免疫反应。此外，肿瘤细胞、髓系细胞和周细胞是促血管生成因子的主要来源。在多种癌症类型中，尖状EC的高比例与不良预后相关。还发现了PSMA是非前列腺癌中尖端样ECs的特异性标记物。本文的亮点在于：1、通过6种癌症数据进行筛选分析，得出的结论更具有说服力；2、将单细胞数据当背景基因集对TCGA数据进行注释，无论是在scRNA-seq数据的角度还是在bulk RNA-seq数据的角度都比较了尖状EC在肿瘤组织和正常组织中含量的差异；3、通过细胞通讯的分析确定了促血管生成因子的主要来源；4、通过尖状ECs中的特异性膜标记物的筛选得到了作为尖状ECs的特异性标记物和治疗靶点。本篇文章对多套数据的整合处理方法也是非常完善的，我们可以学习其对多种癌症单细胞数据的整合方法以及作者对于每一个得到的结论通过数据验证的同时积极验证这个结论在其他癌症中是否会存在相同结论的思考问题方式。

参考文献：Zhang J, Lu T, Lu S, Ma S, Han D, Zhang K, Xu C, Liu S, Gan L, Wu X, Yang F, Wen W, Qin W. Single-cell analysis of multiple cancer types reveals differences in endothelial cells between tumors and normal tissues. Comput Struct Biotechnol J. 2022 Dec 30;21:665-676. doi: 10.1016/j.csbj.2022.12.049 . PMID: 36659929 ; PMCID: PMC9826920 .