今年3月1日发表在Cancer Discovery（IF：38.272）的一篇文章，发现了一种以前未被识别的泛素连接酶复合物，BICR6模块。通过泛素化和抑制HRI（血红素调节抑制剂，综合应激反应适应途径的一个组成部分），选择性地促进具有高度非整倍体的上皮肿瘤亚群的存活。小编通读了整篇文章之后想到了很多个生信可以研究的思路，不知道优秀的你是不是也能get到其中的关键呢~

下面我们详细看一下：

A Ubiquitination Cascade Regulating the Integrated Stress Response and Survival in Carcinomas

调节癌症综合应激反应和生存的泛素级联

背景

突变癌基因小分子抑制剂的鉴定在某些情况下导致了显著的肿瘤反应。尽管取得了这些成功，但许多癌症并没有药物致癌基因突变，单药治疗很少导致肿瘤完全消退。综合应激反应（ISR）是一种由多种应激信号激活的信号级联，支持蛋白质稳态的维持。许多不同的应激刺激，包括氧化应激、病毒感染、内质网（ER）应激、线粒体失调和氨基酸缺失，集中于四种激酶之一的激活：血红素调节抑制剂（HRI，也称为EIF2 AK1）、蛋白激酶R（PKR）、蛋白激酶R样ER激酶（PERK）、或general control nonderepressible 2（GCN2）。一旦激活，这些激酶介导真核翻译起始因子2（eIF2）的磷酸化和失活，导致蛋白质合成的普遍减少。以前的研究已经证明了癌症中ISR信号的异常激活及其对癌症发病机制的贡献。然而，这些研究并没有解决该途径的选择性激活是否会导致癌症的独特脆弱性。

在这里，作者分析了一个由CRISPR–Cas9功能丧失筛查组成的癌症依赖性数据集，该筛查在1086个癌症细胞系中进行，以确定同质基因模块。该方法确定了癌症细胞系亚群适应度所需的蛋白复合物和信号通路，其中包括一种以前未被识别的功能性泛素连接酶复合物，通过阻止这些细胞中ISR的过度激活，使部分上皮性癌症细胞存活。这项研究揭示了一种新的ISR调节机制，以及与癌症细胞中ISR激活相关的潜在可利用漏洞。

结果

通过同源性分析识别BIRC6泛素化模块

为了确定选择性必需的信号通路或蛋白质复合物，作者试图找到在大量癌症细胞系中表现出同质性特征的基因簇，以下称为同质性模块。基于相关性的显著性和重要性的方差，作者选择了50个顶级同源基因模块（图1A）。在这50个同质性模块中，蛋白质复合物和信号通路先前与特定癌症类型的发病机制有关（图1A），这证实该方法确定了对特定癌症生存至关重要的通路。作者还鉴定了迄今未被识别的共本质复合物，包括由四个参与蛋白质泛素化的基因组成的模块：UBA6、BIRC6、KCMF1和UBR4，将这些共本质基因称为BIRC6模块。这四个基因不仅在CRISPR筛查数据集中密切相关，而且在707个癌症细胞系中进行的基因组规模RNAi筛查数据集中也密切相关（图1B）。

为了进一步评估BIRC6模块基因作为选择性和可利用的癌症脆弱性的潜力，作者分别检查了这些基因的重要性特征，结果显示四个基因都表现出高方差和强表型的重要性特征（图1C，D）。上皮衍生细胞系通常比间充质组织衍生癌症细胞系更依赖BIRC6模块，并且对该模块的依赖性在乳腺癌、头颈癌和食管癌中尤其丰富（图1E，F）。

BIRC6依赖性的体外和体内验证

经过细胞活力测定发现，这些基因的耗尽降低了依赖细胞系的增殖和存活，其程度显著大于非依赖细胞系。BIRC6耗竭对细胞适应性的强烈影响，以及BIRC6依赖性的选择性分布，表明它是该模块的关键组成部分。尽管BIRC6敲除显著降低了所有依赖细胞系中的细胞生存能力，但对非依赖细胞系的影响与切割对照的影响相似（图2A）。正交试验结果显示BIRC6的耗尽导致依赖细胞系中选择性地降低了细胞活力（图2B）。这些观察结果表明，BIRC6在癌症细胞亚群中是选择性必需的，并且这种E2连接酶在至少某些类型的非转化细胞中是可有可无的。

为了深入了解BIRC6耗竭影响细胞生存能力的机制，作者评估了三种依赖性和三种非依赖性细胞系中BIRC6敲除后的细胞周期概况和凋亡水平，发现BIRC6耗竭导致三种依赖性细胞系中S期细胞的比例一致降低，但三种非依赖性细胞却没有降低（图2C），所有三种依赖性但只有一种非依赖性细胞系中都诱导了早期和晚期凋亡（图2D）。因此，BIRC6抑制影响依赖细胞系的增殖和存活。

在体外证实了BIRC6的选择性重要性后，作者试图评估体内BIRC6抑制的效果，特别是对肿瘤生长和维持的影响。首先，生成了一种靶向BIRC6的多西环素诱导的短发夹RNA引入到ZR751细胞（雌激素受体阳性乳腺癌症细胞系）中，并制备肿瘤模型。在多西环素喂养的小鼠组中观察到BIRC6敲除后的稳健肿瘤消退（图2E）。类似地，BIRC6非依赖性食管癌症模型小鼠，BIRC6的缺失无法改变肿瘤的生长速度（图2F）。相反，与对照组相比，BIRC6依赖性肺癌模型小鼠BIRC6的缺失导致原发性肿瘤的快速消退和肺和肝脏转移负担的显著降低（图2G）。这些观察结果表明BIRC6是一种高度选择性依赖、对不同癌症谱系的体内肿瘤生长有强烈影响。

BIRC6模块的生化研究

BIRC6是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的成员，具有独特的泛素结合（UBC）结构域。为了评估观察到的对BIRC6的依赖性是否需要BIR和/或UBC结构域，作者开发了一种竞争分析，其中直接比较了两种不同细胞群体的增殖/存活情况：一种含有沉默突变，另一种携带破坏BIR或UBC功能域的破坏性突变。

实验结果显示，UBC结构域赋予的BIRC6 E2泛素结合酶功能，而不是BIR结构域功能，对依赖细胞的生存至关重要（图3A，B）。并且UBA6（E1）、BIRC6（E2）和KCMF1/UBR4（E3）之间存在物理相互作用，并表明这些成员共同形成泛素连接酶复合物，其功能反过来对一部分上皮性癌症细胞的增殖/存活至关重要（图3C-F）。

BIRC6耗尽后ISR的激活

为了了解BIRC6选择性依赖的机制基础，作者研究了BIRC6抑制引起的转录变化。在依赖细胞系模型中，BIRC6抑制后，700多个基因的表达发生了显著变化（图4A）。与G2–M检查点进展相关的基因和E2F靶基因的下调，以及与凋亡相关的基因的上调。参与未折叠蛋白应答（UPR）的基因仅在依赖BIRC6表达生存的细胞系中高度上调（图4B）。并且UPR的p-eIF2β/ATF4臂在BIRC6依赖和非依赖细胞中都是完整的（图4C）。但是，没有发现ATF6和IRE1/XBP1（UPR另外的两个独立信号）通路激活的迹象，这两个UPR分支的靶基因没有显著上调（图4D）。这些观察表明p-eIF2α/ATF4信号的选择性激活是依赖细胞中BIRC6复合物抑制的共同结果。

UPR的典型激活涉及ER驻留激酶PERK诱导p-eIF2α/ATF4信号传导。然而，这种p-eIF2α/ATF4信号通路也可以被其他三种eIF2α激酶中的任何一种激活：HRI、PKR和GCN2（图4E）。这些eIF2α激酶的应激依赖性激活及其随后触发p-eIF2α/ATF4信号的能力统称为ISR。也就是说，BIRC6泛素连接酶复合物的阻断导致ISR的选择性激活。

BIRC6抑制后HRI触发ISR

为了测试在抑制BIRC6复合物时观察到的生存能力丧失是否需要ISR激活，作者使用了一种小分子ISR抑制剂（ISRIB）。结果发现，ISRIB处理不仅恢复了ISR激活的下游效应，包括ATF4和ATF3的诱导（图5A），还挽救了UBA6、BIRC6、KCMF1和UBR4耗竭导致的生存能力损失（图5B）。

为了阐明BIRC6耗竭与ISR激活之间的联系，作者进行了基因组规模的CRISPR–Cas9功能缺失筛查，以确定BIRC6依赖性的抑制剂，结果证实了在BIRC6耗竭时对HRI的选择性要求（图5C-E）。为了确认HRI（而不是其他eIF2α激酶）的耗竭是否挽救了BIRC6抑制导致的生存能力损失，作者首先使用CRISPR–Cas9基因靶向在HCC02和SNU503细胞中耗尽HRI或PERK，并测量了随后BIRC6敲除对ISR激活和细胞生存能力的影响。结果发现，HRI的耗竭（而不是PERK）阻断了ISR激活，并损害了细胞活力的降低，所有这些都是在BIRC6敲除后强烈诱导的（图5F和G）。这些结果表明HRI是将BIRC6复合物抑制与ISR激活联系起来的关键效应器。

BIRC6复合物泛素化HRI

为了确定BIRC6泛素连接酶复合物的推定靶点，并深入了解该复合物的抑制触发HRI介导的ISR激活的机制，作者研究了BIRC6抑制对蛋白质组的影响。ISRIB处理恢复了BIRC6耗竭引起的绝大多数蛋白质组变化，包括许多ISR调节基因产物的表达（图6A和B）。HRI分别是在不存在和存在ISR抑制剂（ISRIB）的情况下，BIRC6耗尽后第25和第3个显著上调的蛋白（图6A）。

泛素化级联的其他成员（UBA6、KCMF1和UBR4）的耗尽和蛋白酶体抑制剂MG132的处理都导致这两种细胞系中HRI表达升高（图6C）。这些观察结果排除了HRI上调是ISR激活导致的二次变化的可能性，并强化了HRI是BIRC6复合物的直接效应者的观点，将该复合物与ISR联系起来。环己酰亚胺追踪试验检查BIRC6敲除的后果，结果表明BIRC6耗尽导致HRI稳定（图6D）。但BIRC6的缺失减少了HRI泛素化的形式的出现（图6E）。BIRC6的耗竭导致HCC202细胞中磷酸化和非磷酸化形式的HRI表达增加（图6G）。这些观察结果表明HRI是BIRC6复合物的直接泛素化/降解目标，并且BIRC6复合物可能通过稳定这种激酶的表达而不是主动触发其磷酸化来增强HRI的活性。

与这一概念一致，HRI的耗尽导致六种BIRC6依赖细胞系中多种ISR标记物（包括p-eIF2α、ATF4、ATF3和SESN2）的表达一致减少，但六种BILC6非依赖细胞系没有减少（图6H）。BIRC6依赖和非依赖细胞系之间HRI组成活性的差异表明，HRI的稳态活性决定了BIRC6的依赖性。

BIRC6依赖性在高度非整倍体的肿瘤细胞中富集

最后，为了评估目前研究的信号级联，即BIRC6泛素连接酶复合物→HRI降解→抑制HRI介导的ISR对人类癌症的激活。作者分析了人类正常与肿瘤样本中其产物直接参与该信号级联的基因的表达水平。结果显示，与正常样本相比，HRI在肿瘤样本中的表达显著升高，表明高HRI表达的肿瘤细胞也需要高表达BIRC6复合物成分，以降解HRI并减轻HRI激活的ISR的影响，证实了目前研究的信号级联与人类癌症的相关性。作者生成并探索了另一个侧重于癌症相关遗传变化的数据集，其中包括癌基因功能的获得、抑癌基因功能丧失，以及与染色体异常和微卫星不稳定性等全球基因组变化相关的特征。分析揭示了非整倍体程度与BIRC6依赖性之间的显著相关性（图7A和B）。

事实上，BIRC6与UBA6和UBR4一起，是非整倍体分数高的细胞中最显著的遗传依赖性之一，整数分数从0到39，根据臂水平染色体增益和损失的数量分配给每个细胞系（图7C）。一致地，具有高非整倍性分数的细胞系组比具有低非整倍度分数的细胞组更依赖BIRC6（图7D）。类似地，最强烈依赖BIRC6的细胞系组表现出明显高于最不依赖BIRC6的细胞系组（图7E）。总之，这些观察结果突出了非整倍体的程度与BIRC6的依赖性之间的强烈关联，并表明了使用非整倍性来识别要通过BIRC6抑制策略治疗的患者的潜力（图7F）。

讨论

更广泛地说，这项研究提供了一种方法来识别新的非肿瘤驱动的癌症靶点。本研究还整合了基因组工程、基因组规模抑制筛选和蛋白质组分析，不仅鉴定了一种新的泛素连接酶，而且还解释了这种BIRC6泛素连接酶调节ISR和细胞适应性的机制。因此，这种方法提供了一种可靠的途径来识别和证明致癌途径和靶点，同时识别这些依赖性背后的机制，预计这种方法将为癌症药物开发开辟新的途径。

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BIRC6泛素连接酶生信思路

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