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Cancer Cell ：肿瘤微生物+单细胞+免疫，最新前沿！
肿瘤微生物与宿主细胞以及与肿瘤免疫微环境的互作研究已成为最新科研前沿。2022年6月，Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology发表了题为The tumour-associated microbiome的评论文章，阐述了肿瘤相关微生物与肿瘤微环境的关系以及对癌症治疗的影响。2022年11月，Nature杂志上共同发表了题为Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer的文章，揭示了肿瘤微生物与宿主细胞的相互作用，其中为了揭示两者在单细胞层面的关系，作者用了单细胞RNA测序技术去捕获微生物的转录本信息。由此可见，肿瘤微生物+单细胞+免疫，已成为肿瘤研究的最新前沿！
今天小编给大家带来2022年10月发表在Cancer Cell（IF:38.585）上的肿瘤微生物研究，该研究基于单细胞技术分析肿瘤微生物与宿主的相互作用，揭示胰腺癌中与肿瘤细胞特异性配对的微生物，它们的存在与细胞类型特异性基因表达和通路活动有关，包括细胞运动和免疫信号传导。同时该研究揭示了肿瘤-微生物组串扰可能调节胰腺癌的肿瘤发生，对临床管理具有意义。
前言
研究表明胰腺癌患者的肿瘤中含有多样化的微生物群，以及与微生物肽具有同源性的肿瘤新抗原。.这些微生物群产物可改变基因调控，诱导DNA损伤，刺激模式识别受体，增强突变KRAS信号，诱导炎症发生和免疫抑制，与胰腺癌患者的化疗耐药性和预后显著相关。
肿瘤微生物的研究存在以下难题，许多肠道微生物难以培养、个体间的微生物组差异大、少有模型揭示肿瘤-微生物间细胞层面的相互作用以及术后样本污染使数据分析复杂化等。在本研究中，作者使用宿主-微生物组相互作用的单细胞分析技术SAHMI，在单细胞分辨率下检测胰腺癌中的肿瘤-微生物组关系。
研究结果
scRNA-seq数据中宏基因组reads的检测和验证
作者基于开发的SAHMI技术在单细胞分辨率下评估宿主-微生物组之间的相互作用。简单来说，SAHMI将读取单细胞RNA测序数据的reads，并用基于K-mer分类方法的Kraken2Uniq软件与参考宿主和微生物基因组进行比对并降噪，SAHMI通过使用分位数检验比较单个分类单元计数与其在阴性对照样本中的分布来识别假阳性分类分配和污染，然后，去噪的微生物谱可以与宿主细胞转录组共同分析，可以与共享相同的scRNA-seq cell barcode的单个体细胞配对。
作者整合了两个数据集scPDA1 和 scPDA2，包括41个胰腺导管腺癌（PDA）肿瘤样本和14个正常胰腺组织的数据，SAHMI将94%的reads比对到宿主，4%为未分类，0.6%被分类为微生物物种，包括1962属和7236种。作者在去除可能的假阳性分类和污染物物种后，并与其他技术如16S-rDNA测序的胰腺癌以及其他部位的微生物组数据进行交叉验证比较。这些基准和验证分析表明了SAHMI识别PDA 样本scRNA-seq数据中来自微生物组reads的可靠性和准确性。
PDA中与细胞特异性相关的微生物
作者鉴定出19个同时存在于scPDA1和scPDA2中的细菌属。该研究中，与正常样本相比，肿瘤样本的微生物总数普遍增加。在肿瘤样本中，一部分barcode也标记了体细胞RNA（scPDA1,8.7%；scPDA2,8.9%），这提供了这些细菌与宿主细胞共定位的证据。宿主细胞和细菌的barcode配对表明，这些微生物与体细胞有关，但不能确定它们是细胞内的还是细胞外的，然而已有研究提供成像数据表明在胰腺肿瘤中检测到的大多数细菌都是细胞内的。该研究中作者确定了胰腺癌中独特的细菌相关的肿瘤状态，这与先前的研究报道一致。
作者用UMAP可视化体细胞数据时，观察到细菌在不同细胞类型中的分布并不均匀。同一细胞亚型内，与细菌相关的细胞通常聚集在一起，表现出共享的、广泛的基因表达变化。在所有细胞亚型中，肿瘤细胞中相关细菌总数最多，而免疫细胞与肿瘤内的细菌有非特异性的相互作用。这些数据表明，胰腺肿瘤样本具有改变的微生物群，可能对恶性肿瘤细胞具有细菌趋向性。
微生物与细胞类型特异性的多样性和活动有关
细菌相关宿主细胞的共聚增加了宿主细胞因细菌存在而发生转录变化的可能性。在scPDA1和scPDA2中，带有细胞相关细菌的样本的肿瘤和髓系细胞的多样性显著增加，而T细胞群的多样性显著减少。
作者进一步研究了细菌的存在是否与宿主细胞类型特异性的基因的表达有关。在细菌有/无存在的样本中，共鉴定出571个差异基因，部分基因在scPDA1和scPDA2中具有共同调控方向，肿瘤细胞中差异表达基因的数量最多。例如，艰难梭菌存在的肿瘤细胞，EDIL3表达明显增加，该基因已被报道涉及多种组织的无菌和微生物诱导的炎症，同时和胰腺癌的肿瘤生长和不良预后相关。与幽门螺杆菌共定位的肿瘤细胞中CRABP2的表达显著增加，该基因已被报道为一种致癌基因，在口腔念珠菌病和癌症的体内模型中表达上调。这些数据表明SAHMI鉴定的微生物可能与PDA的关键生长和炎症过程有关。
作者进一步对这些差异基因进行了通路富集分析。结果表明，细胞相关细菌的存在与肿瘤细胞、正常上皮细胞和间质中的细胞运动、胞外基质相互作用和免疫信号传导通路相关。为了验证结果，作者将scPDA1和scPDA2中的细菌相关基因与TCGA胰腺癌队列中发现的细菌相关基因进行了比较，结果具有高度一致性。
考虑到微生物组成的个体间差异和TCGA数据的基因组覆盖范围有限。以上这些单细胞分辨率的观察结果一致地将微生物群与肿瘤微环境中单个细胞类型中关键的癌变相关的细胞过程联系起来。
微生物存在的肿瘤具有激活的T细胞亚型
作者整合了来自scPDA1和scPDA2的T细胞数据，并基于典型亚型标记识别了调节T细胞、记忆、效应T细胞和自然杀伤T细胞。结果表明具有细胞相关细菌的肿瘤的T细胞更倾向于具有激活的表型（即自然杀伤T细胞、效应T细胞）。微生物有/无存在的肿瘤T细胞具有差异表达基因，这些差异表达基因在scPDA1和scPDA2中具有相同的调控方向，并在PD-1通路以及FOXO介导的转录和干扰素信号传导通路中富集。这些结果与最近的报道一致，即肿瘤内细菌诱导免疫浸润和抗肿瘤反应。
PDA中T细胞具有与细菌感染相关的转录信号
该研究中，广泛的细菌-免疫细胞共定位和与免疫相关信号的关联表明，微生物组影响PDA免疫应答。为了确定肿瘤微环境中单个T细胞的靶点，作者构建了一个随机森林模型来准确区分PDA肿瘤微环境中单个T细胞到底受微生物刺激还是受肿瘤刺激。结果表明两个PDA队列中的绝大多数T细胞被归类为具有细菌感染微环境模式。这一发现解释了为什么胰腺肿瘤有高水平的炎症，对免疫治疗反应较差。
微生物组特征与患者生存率相关
由于缺乏大样本量的单细胞PDA队列生存数据，作者开发了一个梯度增强树模型，来分类肿瘤有/无细胞相关细菌的表达，然后使用这个模型来预测公共数据库（TCGA、ICGC和CPTAC）中胰腺癌样本的细菌感染状态，并使用单变量Cox比例风险模型来检验其与生存率的关系。结果表明，肿瘤微生物特征与胰腺癌患者的预后具有显著相关性。
小编总结
在该研究中，作者使用SAHMI在独立的胰腺癌队列中分析了单细胞分辨率下的肿瘤-微生物组相互作用。与宿主细胞相关的微生物与在单细胞分析中确定的大多数细胞类型配对，主要定位于肿瘤细胞。肿瘤微生物的存在与细胞类型特异性的癌症相关过程有关，包括细胞运动、细胞外基质相互作用、补体级联和PD-1信号传导。大多数PDA 中T细胞具有与感染相关的转录反应。同时作者也证实了肿瘤微生物特征与胰腺癌患者的预后具有显著相关性。
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参考文献
Bassel Ghaddar,Antara Biswas,Chris Harris, et al. Tumor microbiome links cellular programs and immunity in pancreatic cancer, Cancer Cell (2022). DOI: 10.1016/j.ccell.2022.09.009
