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今天给大家带来一篇NATURE REVIEWS CANCER的最新综述“RNA splicing dysregulation and the hallmarks of cancer”。本文，作者回顾了癌细胞转录组的剪接改变特征，剪接失调对肿瘤发生和发展的贡献，以及现有的和新兴的靶向剪接用于癌症治疗的方法。最后，讨论了将这些发现转化为临床必须解决的问题和挑战。
RNA剪接是大多数人类基因表达的基本步骤。剪接除了在产生成熟的mRNAs方面发挥重要作用外，还通过无义介导的衰变(NMD)影响基因表达的其他步骤。几乎所有人类多外显子(multi-exon)基因都经历了选择性剪接。RNA剪接失调是几乎所有肿瘤类型的分子特征。肿瘤相关剪接失调可通过多种机制促进肿瘤的发生，包括促进细胞增殖、减少细胞凋亡、增强迁移和转移潜能、抵抗化疗和免疫逃逸等。最近的研究已经确定了在癌细胞转化和生长中发挥关键作用的特定的癌症相关异构体，并证明了纠正或以其他方式拮抗这种癌症相关的mRNA异构体的治疗益处。调节或抑制RNA剪接的临床级小分子也同样被开发为有前途的抗癌治疗药物。
在这篇综述中，作者概述了RNA剪接的基本生物学和与癌症的相关性。讨论了与肿瘤启动有关的剪接调控改变，以及与肿瘤启动、进展和耐药性相关的个体剪接事件。描述了如何用小分子来治疗剪接失调，以及需要解决的技术挑战和悬而未决的问题。
RNA剪接是一个高度调控的过程，由剪接蛋白(一个由RNA和蛋白质组成的复合物)以及调节其活性的额外剪接因子蛋白执行。剪接体识别pre-mRNA中的核心规则序列，包括5’和3’剪接位点(5’ss和3’ss)，标记内含子-外显子边界，分支点位点(BPS)和多嘧啶序列。两个剪接体复合体进行剪接反应，U2型(主要剪接体)或U12型(次要剪接体)。主要的U2型剪接体优先识别GT-AG剪接位点，负责去除~99%的内含子；次要或U12型剪接体识别AT-AC和GT-AG位点，移除不到1%的内含子。几个剪接体成分在人类肿瘤中发生改变，包括通过‘Early’或E complex和pre-spliceosome A complex的反复热点突变（图1a）。
剪接体识别的核心调控序列在人类中具有巨大的多样性。这提供了一层额外的调控。顺式作用序列和反式作用剪接因子共同调节选择性剪接，使单个基因能够编码多种不同的RNA异构体，这些异构体可以翻译成功能不同的蛋白质异构体(图1b)。剪接异构体可以在其编码潜力、稳定性、定位、翻译效率和其他分子特征方面有所不同。据目前估计，每个人类蛋白质编码基因平均编码7.4种RNA亚型。
调节可变剪接的反式作用剪接因子是一类RNA结合蛋白(RBPs)，它识别和结合pre-mRNA上的顺式调节元件，即外显子/内含子剪接增强子(ESE/ISE)或外显子/内含子剪接沉默子(ESS/ISS)序列，并分别促进或抑制该外显子进入成熟mRNA(图1c)。富含丝氨酸/精氨酸(SR)的蛋白质和异质性核糖核蛋白(HnRNPs)是两个众所周知的剪接因子家族。HnRNPs在选择性剪接、mRNA运输和翻译中发挥着不同的作用，并且经常作为SR蛋白调节的选择性剪接事件的拮抗剂。
SF3B1、SRSF2、U2AF1和ZRSR2基因重复性突变常见于血液系统恶性肿瘤，包括骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)等。这些突变通常被称为“剪接体突变”。
SF3B1是癌症中最常突变的剪接体成分，SF3B1突变影响羧基末端HEAT域(HD)内的多个hot-spot残基(图2a，b)。这些突变导致BPS识别的改变，随之而来的是广泛的剪接改变。SF3B1突变的预后意义取决于特定的突变和适应症，例如MDS中，SF3B1K700E与相对较好的预后相关，而SF3B1K666N与疾病进展相关。CLL中，SF3B1G742D与预后不良相关。虽然突变的SF3B1如何促进疾病表型和肿瘤的发生仍在积极的研究中，但已经涉及到许多细胞途径。
在所有MDS和相关疾病的患者中，有10%的患者观察到了SRSF2的反复突变，并MDS的预后不良有关。SRSF2是结构性剪接和选择性剪接所必需的。紧邻SRSF2’s RRM结构域的杂合突变，主要为错义突变，普遍影响P95残基(图2b)，改变其RNA结合偏好。突变体SRSF2有利于识别富含C的序列(CCNG基序)，并降低了对GGNG基序的亲和力，而野生型SRSF2同时识别两者。这改变了SRSF2介导的外显子包涵体的效率，并导致错误剪接。
U2AF1在5-15%的MDS、5-17%的慢性粒单核细胞白血病（CMML）和3%的肺腺癌中发生突变(图2a)。U2AF1的两个锌指结构域中的S34和R156/Q157受到反复突变的影响(图2b)。这两个热点的突变导致RNA结合亲和力和3‘SS识别的不同变化，从而导致截然不同的剪接模式。
ZRSR2基因是一种X连锁基因，在没有环状铁粒幼红细胞的MDS中有1-11%的突变，CMML中有0.8-8%的突变，其他血液病中突变的比例较低(图2a)，大多数突变发生在男性患者中。与上述hot-spot改变相反，ZRSR2突变分布在基因上(图2b)，优先破坏开放阅读框或关键功能残基，导致功能丧失，并可与SF3B1、SRSF2或U2AF1突变共存。
Sf3b1K700E/+基因敲除小鼠表现为大细胞性贫血、红系发育异常和长期的造血干细胞扩增；Srsf2P95H/+基因敲除小鼠表现为造血功能受损、髓系和红系发育不良、造血干细胞扩增；表达U2af1S34F的转基因小鼠表现为造血功能的改变，而U2af1S34F/+敲除小鼠表现为多系细胞减少、大细胞性贫血和低度发育不良；Zrsf2基因敲除小鼠表现为轻度不典型增生造血干细胞自我更新增加。U12型内含子相对于U2型内含子的高度保守可能解释了为什么Zrsr2缺失在小鼠模型中导致竞争优势，由于其在人类疾病中的富集，而其他剪接体突变的小鼠模型则没有。
遗传证据同样表明，剪接体突变通常是髓系恶性肿瘤发病机制的始动事件。对带有SF3B1突变的MDS的克隆性研究表明，这些病变正发生在人类造血干细胞中并在其髓系后代中持续存在。最近的一项纵向研究表明，在人类造血系统和克隆造血老化过程中，由不同的体细胞突变驱动的克隆扩张存在差异。剪切体突变在生命后期驱动扩张，并与恶性肿瘤的转化密切相关，而具有表观遗传调控突变的克隆在生命早期优先扩张，并随着年龄增长表现出较慢的生长。剪接体突变经常以等位基因比率表达，这表明在许多实体肿瘤中存在显性克隆，这表明它们可能也是这些恶性肿瘤的早期事件，甚至是起始事件。
编码其他剪接体成分的基因在血液病和实体恶性肿瘤中也会发生突变(图2)。SF3A1、PRPF8、SF1、HNRNPK、U2AF2、SRSF6、SRSF1、SRSF7、TRA2B和SRRM2突变也已被报道，尽管突变的发生率相对较低。这种低频剪接因子突变在癌症中的功能作用尚不清楚，它们可能是潜在的重要角色。
剪接因子水平和活性通过与NMD结合的选择性剪接，在翻译和翻译后，包括通过特定激酶的磷酸化，在表观遗传、转录和转录后受到严格控制。这些调控通路中的任何一个的改变都可以导致剪接因子表达的改变，从而改变剪接因子下游靶标的选择性剪接。尽管反复发生的剪接因子突变在血液系统恶性肿瘤中很常见，但剪接因子水平的改变和拷贝数的变化在实体肿瘤中尤为突出(图2a)。剪接因子调控失调与多种癌症之间的因果联系已被确定。在乳腺癌中上调的几种剪接因子具有致癌功能。当然，剪接因子也可以作为肿瘤抑制因子。
促肿瘤剪接因子的一个典型例子是SR蛋白SRSF1，在乳腺、肺、结肠和膀胱肿瘤中的上调。SRSF1的过表达增强了与减少细胞死亡、增加细胞增殖以及抵抗DNA损伤相关的异构体的选择性剪接，导致体内和体外的细胞转化。SRSF1可以与转录因子MYC协同作用，通常导致乳腺癌和肺癌患者病情加重。
另一个SR蛋白家族成员SRSF3在肺、乳腺、卵巢、胃、膀胱、结肠、骨、肝、脑和口腔肿瘤中过表达，而在肝细胞癌中观察到SRSF3的表达降低，这表明在肿瘤的发生中起着复杂的作用。SRSF3靶基因在细胞代谢、生长、细胞骨架组织和选择性剪接中发挥作用。
在癌症中经常上调的其他剪接因子包括SR蛋白家族的其他成员，hnRNP蛋白家族的成员以及其他剪接因子，例如ESPR1、ESPR2、RBM5、RBM6和RBM10(图2a)。相反，几个剪接因子在人类肿瘤中下调，包括hnRNPK、ESRP1、ESRP2、RBFOX2、RBM5或QKI(图2a)。其中QKI在多种肿瘤中检测到水平降低，并与不良预后有关。除了上面讨论的SRSF3，其他剪接因子也可以根据肿瘤类型而上调或下调，这表明上下文相关的功能既可能促癌也可能抑制癌症，在调节组织特异性剪接中扮演着复杂的角色。更复杂的是，在口腔肿瘤中，正常上皮中低水平表达的ESRP1在癌前病变、原位癌和晚期病变中上调，但在浸润性肿瘤前沿下调。另一个具有双重功能的剪接因子是RBM5，它通常被认为是一种肿瘤抑制因子，在肺癌和前列腺癌中下调，但在原发性乳腺癌中上调。
肿瘤通常比正常组织表现出更复杂的剪接过程，肿瘤的致瘤性可能与转化过程中出现的癌症特异性选择性剪接有关。在某些情况下，顺式作用突变可以破坏剪接以促进肿瘤发生。而其他顺式作用突变同样可以通过诱导特定内含子的保留来扰乱基因的表达。
癌症特异的选择性剪接经常独立于这种顺式作用突变或影响剪接因子的反复突变的存在而出现。这种选择性剪接开关影响数千个基因，通常是特定肿瘤类型或亚型所特有的。尽管如此，许多选择性剪接异构体经常在多种肿瘤类型中不受调控，这表明跨组织类型共享剪接调控网络。
这些失调的异构体经常影响所谓的癌症特征，即在人类肿瘤发展过程中获得的一系列生物学能力。癌症相关的选择性剪接异构体可以提供增殖优势，改善细胞迁移和转移，使细胞能够逃脱死亡，重新连接细胞代谢或细胞信号，促进微环境，改变免疫反应或使耐药(图3)。这种与癌症相关的选择性剪接开关可以由剪接因子水平或活性的变化、影响特定剪接位点或外显子的顺式作用突变或其他方式引起。模型系统中的功能研究表明，单一异构体的改变可以影响肿瘤的生长，但通常不足以完全概括剪接因子介导的转化，这表明可能需要多种选择性剪接异构体开关的组合来促进肿瘤发生的不同步骤。
肿瘤中的差异剪接可以导致异构体的表达，从而增加增殖潜力(图3)。例如，RPS6KB1基因的剪接与细胞的持续增殖和肿瘤的生长有关。RPS6KB1-2在乳腺癌、肺癌细胞系和原发肿瘤中高表达，敲除该基因可抑制癌细胞增殖和肿瘤生长，反之，RPS6KB1-1基因敲除可诱导转化。
PKM基因的剪接可以下调细胞代谢(图3)。PKM1或与癌症相关的PKM2亚型相差22个氨基酸，虽然两者执行相同的催化功能，但PKM2可以在活性和非活性状态之间切换。人实体瘤中PKM2水平高与患者生存期短、分期晚、预后差有关。
为了生存，癌细胞需要获得抵抗细胞死亡的能力。多个控制细胞死亡的基因在剪接水平上受到调控，产生不同的异构体，这些异构体要么具有抗凋亡功能，要么具有促凋亡功能，包括bcl2家族成员，如BCL2L1、BIM或MCL1(图3)。BCL2L1产生BCLxL和BCLxS两种亚型，分别抑制和促进细胞凋亡。
基因组不稳定性是肿瘤的标志之一，而感知单链DNA断裂并激活DNA损伤反应的蛋白质之一是丝氨酸/苏氨酸检查点激酶CHK1(图3)。跳过CHK1产生较短的异构体CHK1-S抑制全长CHK1。卵巢癌、睾丸癌和肝癌组织中检测到高水平的CHK1-S。
几乎所有的癌细胞都通过上调端粒酶来重新延长或维持端粒。端粒酶的逆转录酶组分TERT的剪接可以产生至少22种不同的亚型，它们的活性不同；其中许多缺乏端粒酶活性，并具有显性的负面影响(图3)。
一个肿瘤抑制因子逃避例子是转录因子KLF6，它调节细胞的增殖、分化和生存，可抑制肿瘤，通常通过突变或缺失在肿瘤中失活(图3)。KLF6的选择性剪接可以产生致癌亚型KLF6-SV1。KLF6剪接受SRSF1、TGFβ1和RAS信号调节。在前列腺、肺、卵巢、脑、乳腺、胰腺和肝脏肿瘤中检测到KLF6-SV1水平升高，并与较差的存活率相关。KLF6-SV1基因敲除可促进细胞凋亡并阻止肿瘤生长，而其过表达则在体内外促进癌细胞的增殖、存活或侵袭。
许多选择性剪接异构体与增加细胞侵袭、血管生成和转移扩散有关(图3)。几个编码调节细胞黏附和迁移的蛋白质的基因在细胞侵袭或EMT过程中表达不同的剪接异构体。其中包括CD44、RAC1、RON或MENA的选择性剪接，这些剪接产生使细胞侵袭和转移扩散的亚型。例如，MENA是一种肌动蛋白成核和聚合的调节剂，调节细胞的形态和运动，它产生三种主要的异构体，在肿瘤进展中扮演不同的角色。包含在乳腺和肺肿瘤中表达的MENA-INV，MENA11a以及MENA∆v6亚型。这些剪接事件受许多剪接因子的调控，包括ESPR1和ESPR2。异构体比例在肿瘤进展过程中发生改变，与肿瘤分级和转移相关的MENA-INV和MENA∆V6增加，MENA11a减少。
剪接开关还可以影响血管生成，促进肿瘤生长和向远处器官扩散(图3)。VEGFA是一种促进内皮细胞增殖和迁移的生长因子，它的选择性剪接导致在血管生成中具有不同功能的蛋白质异构体。包含促血管生成的VEGFAxxx亚型，以及抗血管生成的VEGFAxxb亚型。这两种异构体在体外与其受体具有相似的结合亲和力；然而，VEGFAxxb不能刺激血管内皮生长因子信号转导，从而抑制血管生成。SRSF6促进VEGFAxxb的剪接，而SRSF1和SRSF5使平衡向VEGFAxxx亚型转移。抗血管生成基因VEGFAxxb的表达通常随着肿瘤的进展而减少，其过表达可抑制小鼠肿瘤的生长。
通过对间质和免疫成分的影响，选择性剪接与肿瘤微环境的变化有关(图3)。几种细胞外基质成分在肿瘤进展过程中经历了选择性剪接。包含纤维连接蛋白ED-A会产生在胚胎发育和恶性肿瘤细胞中表达的亚型。类似地，肿瘤特异性的TnC(TNC)或骨桥蛋白(SPP1)亚型与疾病进展有关。此外，细胞外基质硬度和组成的变化可以导致差异剪接，例如，通过差异磷酸化和剪接因子激活。
最后，选择性剪接也影响免疫细胞发育和功能的多个调控步骤(图3)。例如，CD45的选择性剪接是T细胞激活过程中的关键步骤，而CD44选择性剪接参与了淋巴细胞的激活。选择性剪接调控多个介导Toll样受体信号的基因，并控制TLR信号正调控因子的产生，包括IRAK1、CD14和IKKβ，以及负调节因子TLR4和RAB7B的产生。同样，白介素受体的可溶性异构体，如IL-4R、IL-5R和IL-6R，是通过免疫细胞中的选择性剪接产生的。
选择性剪接的改变可能通过影响靶向或信号转导途径而导致靶向治疗耐药(图4)。BRCA1Δ11q异构体促进对顺铂的抵抗。对PARP抑制具有抗性的BRCA1野生型结肠癌细胞表达BARD1β。BARD1β的表达与同源重组受损相关，其外源性表达增加了对PARP抑制剂的耐药性。同样，由SRSF1调控的BH3-only促凋亡蛋白BIM的剪接与酪氨酸激酶抑制剂的反应和耐药性有关。最后，HER2的选择性剪接产生的Δ16HER2降低了对HER2靶向抗体曲妥珠单抗的敏感性。
针对CD19的免疫疗法是治疗B细胞急性淋巴细胞白血病的一个突破。然而，由于免疫排斥和T细胞衰竭或靶向表位的丢失，50%的患者会复发。CD19的选择性剪接可能导致表位丢失，产生不被CAR T细胞识别的剪接异构体，导致耐药(图4)。
鉴于剪接在肿瘤发生中的关键作用，人们对靶向可变剪接用于癌症治疗产生了浓厚的兴趣。从抑制关键剪接体蛋白或调节剪接因子到调节特定的选择性剪接事件，正在进行临床前和临床开发。下面讨论这些方法，从broad-spectrum剪接到特定的异构体水平方法，最后讨论已显示出临床前潜力的新方法(图5)。
以核心剪接体为目标。靶向剪接用于癌症治疗的一种方法是抑制剪接体本身。SF3B1是一种剪接体成分，对BPS和3‘SS选择至关重要(图1)，限制其功能会在剪接体组装的早期阶段扰乱剪接。已确定或开发了多种以SF3B1为靶点的天然产物和衍生分子，包括FR901464及其衍生物，sudemycin E，Pladienolide B，FD-895及其衍生物，以及Herboxdiene(图5)。在机制上，抑制SF3B1阻止了BPS的识别，并导致结构性剪接和选择性剪接的广泛干扰，包括与细胞增殖和死亡有关的转录本。有趣的是，只有一部分内含子和选择性剪接事件受到SF3B1抑制的影响，这表明一些剪接位点比其他剪接位点对剪接体抑制物更敏感。与野生型细胞相比，携带剪接体基因反复突变的癌细胞对SF3B1抑制剂特别敏感；然而，还没有开发出仅针对突变的SF3B1的化合物。几种SF3B1抑制剂已经进入临床试验。鉴于SF3B复合体在正常剪接中的关键作用，目前尚不清楚在临床环境中是否有足够的治疗指数来抑制野生型SF3B1的功能。另一种broad-spectrum剪接体抑制剂是异银杏黄酮，它导致剪接体前A complex的停滞。在临床前模型中，异银杏黄酮治疗影响许多与癌症相关的途径，包括细胞死亡、侵袭和免疫反应。
以可变剪接因子为目标。针对特定RBPs和剪接因子的抑制剂的开发一直具有挑战性，部分原因是缺乏大多数经典小分子抑制剂方法容易靶向的催化活性位点。偶然发现几个芳基磺胺类化合物通过先前未知的作用机制具有抗癌活性，它们作为分子胶通过募集到CUL4-DCAF15泛素连接酶复合体而导致RBP RBM39的降解(图5)。鉴于特定剪接因子的高表达和低表达是常见的，并可促进肿瘤的发生，开发纠正剪接因子表达的方法可能具有治疗价值。目前还没有这种针对单个剪接因子的通用方法。
以上游调控蛋白为目标。剪接因子受到广泛的翻译后修饰，这为治疗干预提供了机会。例如，剪接体蛋白和剪接因子受到广泛的精氨酸甲基化的影响。PRMT5本身是MYC癌基因的直接靶点，在MYC驱动的肿瘤和选择性剪接之间提供了联系。已经确定了许多抑制I型或II型PRMTs的小分子(图6)。I型和II型PRMT抑制剂都显示出良好的临床前活性。
许多剪接因子，特别是SR蛋白，是高度磷酸化的。这些磷酸化事件改变了剪接因子的活性和定位，并最终是其剪接活性所必需的。因此，抑制调节这些磷酸化事件的激酶可能是降低致癌SR蛋白活性的可行策略(图6)。另一种化合物TG003通过抑制CDC样激酶1(CLK1)影响SR蛋白的磷酸化，并在前列腺癌和胃癌模型中显示出抗癌作用。
总之，多种诱导Broad-spectrum剪接调节的方法显示出临床前的前景，目前正在临床上进行测试。然而，由于所有现有的方法都影响健康和恶性细胞的剪接，仔细评估潜在的毒性和治疗指数是至关重要的。鉴于目前的限制，选择性靶向或以其他方式拮抗突变剪接体蛋白的新构象活性的化合物的未来发展有可能产生实质性的治疗益处和有利的副作用。
以个别亚型为靶标的小分子。由于许多疾病相关的剪接因子目前还不能用小分子药物治疗，靶向下游错误剪接RNA可能提供一种有前景的治疗方法。然而，到目前为止，只有少数通过靶向特定RNA转录本发挥作用的化合物显示出临床用途。Risplam是FDA批准的第一个用于治疗脊髓性肌萎缩症的小分子药物，它通过靶向RNA转录本发挥作用。在过去的5年里，识别以特定癌症相关RNA为靶点的小分子的研究有所增加。以RNA为靶标的小分子配体可以通过考虑每个小分子的首选结合位置或RNA结构进行合理设计。小分子可以通过空间位阻诱导RNA的靶向降解、直接切割或剪接调节。然而，这种方法在遗传病方面的发展比在肿瘤学方面要先进得多。
用寡核苷酸进行剪接调控。基于RNA的疗法提供了改变pre-mRNA剪接的可能性。剪接开关ASOs是一种经过化学修饰的短RNA寡核苷酸，旨在与靶pre-mRNA中的反向互补序列结合，从而防止其与剪接机制的相互作用(图6)。剪接开关ASOs可以被设计成专门针对5‘SS或3’SS，从而阻止其使用；剪接增强子序列；剪接沉默序列；或由于突变而出现的神秘剪接位点，从而恢复野生型剪接位点。对磷酸骨架、核糖环的化学修饰产生了高度稳定的ASO，具有高底物专一性、低毒性、低免疫原性和降低核糖核酸酶H的降解率。将ASO输送到靶组织对其广泛的治疗用途仍然是一个巨大的挑战，除了向肝脏输送外，GalNAc偶联对其非常有效。目前FDA批准的剪接开关ASO可以直接或系统地传递到它们的目标位置，但传递到一些组织，包括肿瘤，仍然具有挑战性。
尽管在体内传递存在挑战，但针对癌症的ASO已经增加。在许多情况下，ASO纠正与癌症相关的选择性剪接事件导致了在细胞系和动物模型中有希望的抗癌表型(图5)。例如，编码BCL-x(BCL2L1)的基因可以被选择性地剪接，以产生促凋亡的亚型BCLxS或抗凋亡的亚型BCLxL。
针对RNA可变剪接的新策略。已经有针对剪接因子或特定选择性剪接事件的新方法。一个例子是诱骗寡核苷酸，它可以诱导类似于靶剪接因子被敲除的转录改变，而SRSF1诱骗可以限制胶质瘤细胞的生长。另一种方法是使用经过改造的U7SnRNA来纠正特定的选择性剪接事件，可以有效地发挥反义分子的作用。这些结构的稳定表达可能会克服传统反义治疗的局限性，因为它们不需要多次给药。到目前为止，这种方法已经用于强直性肌营养不良症、杜氏肌营养不良症、肌萎缩侧索硬化症、β地中海贫血、艾滋病毒感染和脊髓性肌萎缩的模型。
在CRISPR时代，RNA靶向Cas13(CasRx)已被用于碱基编辑靶RNA或改变Pre-mRNA的剪接。在Cas13 RNA靶向能力的基础上，开发了CRISPR人工剪接因子，利用guide RNAs (gRNAs)靶向，将单个剪接因子的剪接活性定向到目标pre-RNA(图6)。通过基于CRISPR的方法进行基因编辑，可以针对特定的选择性剪接事件。通过设计特定的突变，人们可以加强或取消感兴趣目标中的特定剪接位点序列，从而促进外显子的包含或跳过。
变异的、癌症相关的RNA亚型翻译的多肽是免疫治疗的有潜力的靶点。这些癌症特异的新抗原可能源于影响剪接的突变以及异常剪接连接、内含子保留和其他癌症特异性替代剪接的非突变使用。例如，在B细胞淋巴瘤中，CD20的选择性剪接可以产生T辅助细胞反应，这种反应可以选择性地杀死恶性B细胞克隆，而用CD20剪接异构体的相应肽免疫人源化小鼠可以产生强大的T细胞反应。
在这种情况下，肿瘤突变负担是一种新的抗原性潜力的常见指数，并不总是与个体患者对免疫检查点抑制剂的反应相关。选择性剪接衍生新抗原的发现可能是对基因组分析的补充，以确定哪些患者将对免疫检查点治疗产生反应，此外，还代表了免疫治疗潜在靶点的丰富来源，特别是如果可以识别许多患者共享的肿瘤特异性靶点。
另一种方法是剪接调节药物和免疫检查点抑制剂的协同治疗。RBM39降解或PRMT抑制对同基因小鼠肿瘤模型中选择性剪接的治疗调节作用诱导肿瘤细胞错误剪接衍生的新抗原递呈，刺激强大的抗肿瘤免疫反应并增强对检查点抑制的反应。在这种临床前环境中，没有观察到健康组织的毒性或免疫渗透增加的证据，但在临床移植之前，有必要进一步工作以确定安全性。
到目前为止，大多数研究都依赖于short-read RNA-seq来表征人类肿瘤中的选择性剪接谱系(图7)。这些方法揭示了癌症转录组的复杂性，以及细胞转化过程中选择性剪接开关的规模。然而，short-read RNA-seq不能可靠地检测所有异构体。LR-seq方法将提供对肿瘤和正常组织选择性剪接构成的更全面的看法。获得准确的全长剪接异构体序列对于识别私有或共享的新抗原以及针对剪接衍生多肽的免疫疗法的发展至关重要。单细胞LR-seq将是一个非常有效的策略来确定选择性剪接如何有助于肿瘤的进化和药物反应，并识别与耐药相关的肿瘤群体。最后，单细胞LR-seq与空间转录学相结合，揭示了选择性剪接如何促进组织发育和疾病。这种方法对研究肿瘤的发生和发展具有潜在的实用价值，而肿瘤的发生和发展已经与选择性剪接的改变有关。
许多工作已经确定了数千种与癌症相关的选择性剪接异构体。然而，缺乏高通量的方法来大规模查询剪接异构体的功能，阻碍了临床上相关和可操作的替代剪接改变的发现。最近，基于CRISPR的方法已经证明，可以使用成对的gRNA筛选它们对肿瘤细胞生长的影响。然而，这些方法以DNA序列为目标，因此也可能潜在地影响基因组和染色质结构、基因转录和其他调节元件。虽然还需要进一步发展，但在这方面，以RNA为目标的CRISPR方法可能特别有用。最后，需要更好的模型系统来测试恶性肿瘤中选择性剪接改变的功能后果，并对剪接靶向治疗进行临床前评估。其中包括概括肿瘤复杂性的体外模型(例如，有机物和共培养模型)。带有突变剪接因子的同基因小鼠癌症模型也可以提供新的机制见解，并用于测试剪接调节药物的疗效。人源化的小鼠模型将进一步测试针对人类免疫细胞的治疗效果。
在过去的十年中，已经揭示了癌症中选择性剪接异构体和剪接因子的变化程度，但仍然缺乏对这些变化的功能后果的全面了解。肿瘤特异性亚型的相对作用在很大程度上仍不清楚。
此外，肿瘤中大多数剪接异常的机制起源尚不清楚。很大一部分实体肿瘤在选择性剪接或剪接因子水平上显示出显著的变化，但不存在直接影响任何剪接因子的基因组改变。因此，了解剪接因子在健康组织和肿瘤中的表达调控将有助于针对剪接的治疗方法的继续发展。选择性剪接与其他分子过程密切相关，包括表观遗传、转录和翻译水平的调控机制。这些机制中任何一种由癌症驱动的变化反过来都可以影响剪接结果，反之亦然。最后，许多非遗传因素影响癌症的易感性。这包括年龄以及环境和生活方式的差异，如饮食或吸烟。
总而言之，过去十年的研究表明，选择性剪接失调不仅是癌症的偶尔相关因素，而且是一种几乎无处不在的基本分子特征，经常在肿瘤发生中起到致病甚至启动作用。持续的研究会揭示普遍的癌症特异性剪接失调的机制起源和功能后果的新见解，并能够创造出通过调节RNA剪接发挥作用的新癌症疗法。
