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由于缺乏脑成纤维细胞，很多人认为恶性胶质瘤中不存在癌症相关成纤维细胞（CAFs）。今天给大家介绍一篇刚刚发表在JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION（IF：19.456）的文章，作者通过12例胶质母细胞瘤患者的单细胞RNA测序和空间转录组数据，确定了CAF和胶质母细胞瘤干细胞的相互作用。
胶质母细胞瘤(GBM)是一种侵袭性脑癌，预后差。中枢神经系统中缺乏纤维母细胞，因此许多人推测GBM缺乏CAFs，但一些研究已经确定了在GBM中表达CAF标记的细胞。然而，这些研究未能全面描述这些细胞及其对GBM及其微环境的影响。更重要的是，这些研究依赖于细胞表面标记，而没有全面的基因表达谱，这增加了被识别的细胞可能是微环境中的其他细胞的可能性，例如周细胞，毛细血管壁中的细胞与成纤维细胞共享重叠的细胞表面标记。
作者对GBM患者样本进行了5周的胰蛋白酶化，去除较少的粘附肿瘤细胞，从而保留对胰蛋白酶化具有抗性的细胞，这些细胞已被证实为其他癌症中的CAFs。开发了一种分类器方法(VAMPIRE)，来对这些细胞的形态进行量化，以分类和比较不规则的细胞和核形状。VAMPIRE区分GBM细胞和CAFs的准确度为91%。相比之下，当患者GBM样本在没有连续胰蛋白酶化的情况下进行培养时，GBM细胞占主导地位，将具有CAF形态的细胞群减少到18%（图1A，B），这说明连续胰蛋白酶化产生了富含CAFs的细胞群。
Bulk RNA-Seq显示，GBM中的这些CAFs样细胞表现出与乳腺CAFs相似的转录组特征，但与周细胞不同，周细胞的形态和表面标记物表达与CAFs重叠(图1C)。将这些CAFs样细胞与来自8种组织的正常成纤维细胞进行比较，发现这些细胞与真皮成纤维细胞最相似(图1C)。总的来说，这些发现支持了这些细胞是GBM CAFs的假设。
为了严格评估从患者GBM中分离的这些细胞的转录组谱和纯度，作者对其中4385个细胞进行了scRNA-Seq。从GBM分离出的大多数细胞中不存在与CAFs具有某种谱系的细胞表达的标记，包括上皮细胞标记物EPCAM、平滑肌细胞标记物SMTN和内皮细胞标记物PECAM1。
之后，对这4,385个连续胰蛋白酶化细胞排除了表达细胞表面标记的非CAF基质细胞，将其定义为上皮细胞、内皮细胞、周细胞或免疫细胞。在其余75.2%的细胞中，稳定表达CAF标记物的转录物，包括ACTA2和COL1A1。然后，根据5种非CAF标记物的缺失及其上述CAF标记物的表达程度，计算了通过对GBM患者进行连续胰蛋白酶化分离得到的单个细胞的CAF评分(图1D)。CNV分析显示，在连续胰蛋白酶化分离的细胞中，大多数具有高CAF评分的细胞缺乏染色体改变，而一些具有可变CAF评分的细胞表现出7号染色体的增加和10号染色体的丢失，这是GBM的标志(图1E)。从CAF评分高的细胞中筛选这些显示7号染色体增加和10号染色体丢失的细胞，发现通过连续胰蛋白酶化分离出的患者GBMs细胞中52%为CAFs，22%为髓系细胞，20%为恶性细胞，6%为少突胶质细胞(图1F)。
接着作者进行了伪时序分析，揭示了早期CAF群体进化为2种CAF亚型，并计算了从早期到晚期GBM CAFs的不同表达谱(图1G，H)。这些发现与乳腺癌研究一致，表明表达ACTA2的CAFs代表了癌症中分化程度更高的CAF亚型。
为了确定是否可以在患者GBMs的scRNA-Seq中识别CAFs，作者分析了12例患者GBMs的scRNA-Seq结果。发现簇的最佳数量由簇稳定性评分决定，结果在每个患者中看到18个稳健的细胞簇(图2A)。
UMAP图显示肿瘤细胞和基质细胞紧密分组(图2A)，CNV分析显示肿瘤细胞显示7号染色体增加和10号染色体丢失，肿瘤相关基质细胞无染色体畸变(图2B)。计算了单个细胞的CAF分数，12例患者中的每一例都存在CAFs。值得注意的是，具有高CAF评分的细胞簇没有表现出CNV(图2C)。
然后，确定了鉴定的这些CAFs是否具有与胰蛋白酶化分离的scRNA-seq中分离的细胞相同的早期和完全分化的亚型。从GBMs患者中鉴定为CAFs的细胞中提取早期与晚期的伪时间依赖基因，结果显示，虽然通过连续胰蛋白酶化分离的细胞含有早期和完全分化的CAF亚型的混合，但GBMs患者大多含有完全分化的CAF亚型(图2D)。
在GBM的4种恶性细胞状态中，CAFs与间充质样(MES-like)特征在空间上最相关(图2E-G)。CAFs与M2促肿瘤巨噬细胞距离较近，与小胶质细胞和神经元基因标记距离较远(图2G)。CAF也与表达胶质母细胞瘤干细胞(GSC)标记CD44的细胞非常接近(图2H)。由于CAF与表达CD34或CDH5的内皮细胞的接近，从而在GSC所在的血管周围壁龛中富含。
由于GBM CAFs位于靠近肿瘤启动GSCs的血管周围生态位，作者分析了GBM CAFs对GSCs的影响。从GBM6细胞中提取含有GSC的神经球，并在GBMpt3CAFs (CAF_CM)的条件培养基（CM）中培养72小时。利用NanoString nCounter平台和770基因多重PanCancer progression panel对这些细胞进行转录组评估，并与对照神经球介质(NM)中的GBM6神经球进行比较，分析癌基因的表达。分析显示，GBM CAF分泌组上调了癌症进展途径，包括HIF-1α、EMT和GSCs中的细胞增殖(图3A，B)。
然后，作者进行了限制性稀释神经球形成实验，发现与NM相比，GBMpt5CAF CM中GBM6衍生的GSC频率增加，GBMpt5CAF CM在不同稀释度下也增加了GBM6神经球的产量(图3C，D)。
为了识别CAF对GSC影响的介质，使用GBM CAFs和GBM6衍生神经球的RNA-Seq结果，通过将GSC受体的表达映射到CAF细胞表达的同源配体/激动剂的表达，创建了推断的交叉对话资源(图3E)。在从GSC-CAF受体配体分析中鉴定候选基因时，选择骨桥蛋白(OPN)及其受体CD44和肝细胞生长因子(HGF)及其受体c-Met。在抗OPN或抗HGF中和抗体的存在下进行了神经球形成实验。GBMpt5CAF CM增加了GBM6神经球的总面积，这说明了神经球的数量和大小，抗HGF或抗OPN减轻了这一影响。联合抗HGF和抗OPN抗体也减少了GBM6和GBM43球的形成(图3G)。这些结果表明，CAFs诱导的神经球形成的增加是通过OPN-CD44和HGFcMET轴介导的。
根据空间转录组学结果(图2,E-H)，假设GSCs可能将CAFs招募到GBM的血管周围生态位。作者评估了CAFs对GSC CM的跨基质趋化反应(图4A)。发现GSC CM吸引的GBMpt1CAFs是NM的5倍(图4B)。相比于它们在NM中的缺乏生长，CAFs在GBM43细胞或GBM6细胞衍生的GSC CM中生长得更多(图4C)。
然后，为了研究这些GSC对CAFs影响的潜在介质。重点研究了PDGF和TGF-β，因为它们都出现在GSC CAF配体-受体分析中(图4D)。TGF-β中和抗体在2.5 ~ 10 μg/mL时对侵袭无抑制作用(图4E)。就GSC诱导的CAF增殖的介质而言，抗PDGFB的中和抗体和抗TGF-β的中和抗体并没有改变GBM43 GSC CM诱导的CAF增殖，而联合这些抗体可减少GBM43 GSC CM诱导的CAF增殖(图4F)。
然后，在非茎贴壁的DBTRG-05MG细胞中添加GBMpt1CAF CM不改变MES基因表达。通过形状因子评估，GBMpt1CAF CM也没有改变形态，基质腔侵入，或增殖的非茎贴壁GBM6细胞。这些结果表明，GBM CAFs对GSCs的原性作用是特异性的。
RNA-Seq分析显示，纤维连接蛋白(FN;FN1基因) 在GBM CAFs中相对于周细胞有差异表达，由于FN是GBM中最丰富的ECM蛋白，进一步分析了CAF FN1的表达。GBM的FN1表达高于非肿瘤脑样本。GBM也比低级别胶质瘤有更高的FN1表达。定量PCR显示相对于TAM和肿瘤细胞，CAFs中的总FN增加了32倍，EDA剪接变体增加了16倍，这表明EDA是一种比其他CAFs的细胞表面受体更特异性的GBM CAF生物标志物(图5A)。转录组分析还显示，患者GBM中EDA的表达与MES亚型基因CHI3LI、TIMP1和SPOCD1的聚集表达呈正相关，预后较差(图5B)。
当在培养的HUVECs中进行功能检测时，发现将GBMpt4CAF CM添加到没有GBM细胞的培养的HUVECs中，增加了血管生成3个阶段中的前2个阶段，尖端细胞的网络扩张和小管形成，而不影响第三阶段(图5C，D)。这表明CAFs对内皮细胞具有直接的血管生成作用，而不是由GBM细胞增强。
然后，作者研究了CAFs对巨噬细胞的影。与缺乏EDA剪接变体的血浆FN相比，GBMpt2CAF CM和它们产生的FN的EDA剪接变体导致从外周血分离的人单核细胞衍生的培养巨噬细胞产生更多的M2极化(图5E)。同样，当THP-1单核细胞分化为巨噬细胞，然后在GBMpt2CAF CM中孵育时，GBMpt2CAF CM比已知的细胞因子阳性对照更能驱动M2极化(图5F)。在循环人单核细胞来源的培养巨噬细胞中诱导的M2极化GBMpt2CAF CM被抗EDA FN受体TLR4的阻断抗体逆转(图5G)。
为了评估不同肿瘤区域的CAF水平，作者从患者GBMs的不同区域获得了定点活检。沿侧脑室侧壁发现的大脑中最大的生发区，它容纳了神经干细胞，当肿瘤累及该区域时，该区域会产生GSCs(图6A)。脑室下区（SVZ）样本的EDA表达增加了22倍，FN表达增加了22倍，但相对于肿瘤核心，EDB表达仅增加了5倍(图6B)。免疫荧光也显示SVZ GBM富集EDA FN(图6C)。通过流式细胞仪检测表达α-SMA的细胞，SVZ GBM也得到富集，4.9%的肿瘤核心细胞表达α-SMA，而SVZ GBM细胞表达α-SMA的细胞为13.4%(图6D)。在未涉及SVZ的GBM患者尸检的SVZ样本中未出现EDA染色(图6E)。
为了确定CAFs对GSCs的原作用是否也发生在体内，作者将40,000个GBM6神经球细胞颅内植入，并将35,000个GBM6神经球细胞与5,000个GBMpt3CAFs混合植入无胸腺小鼠。在大多数小鼠中，含有神经球的CAFs能够使肿瘤生长达到终点，而没有CAFs则不会发生这种情况(图7A)，这说明CAFs对GSCs的促肿瘤作用也发生在体内。事实上，向35,000个GBM6神经球细胞中添加5,000个GBMpt3CAFs，会导致拥有35,000个GBM6神经球细胞的小鼠与拥有100,000个GBM6神经球细胞且没有CAFs的小鼠在同一时间点到达终点，这些结果揭示了CAFs在体内对GSCs促瘤作用的程度。
在终点分析这些肿瘤时发现，培养中发现的GBM CAFs对微环境的原作用也发生在体内。通过NanoString nCounter平台对体内与CAFs一起生长的GBM6神经球衍生的肿瘤进行转录组分析，与在体内未生长CAFs的GBM6神经球相比，显示HIF-1、EMT和细胞增殖途径基因上调(图7B-D)。肿瘤血管免疫荧光显示，CAFs导致GBM6神经球来源的肿瘤表现出总血管面积/高倍场(hpf)增加(图7E，F)。此外，流式细胞术显示，CAFs增加了GBM6神经球源性肿瘤中CD206+ M2前巨噬细胞的百分比(图7G)。
首先，作者量化了9例新诊断的GBMs中非上皮细胞、内皮细胞、周细胞或免疫细胞，但在scRNA-Seq中至少表达5种CAF标记之一的细胞的百分比。平均而言，这些肿瘤中12.3%的细胞缺乏非CAF基质标记，但至少表达5种CAF标记中的1种。考虑年龄和性别的多变量Cox回归显示，以这种方式确定的生存与CAF水平之间没有相关性。其次，使用TCGA数据集发现，当肿瘤表现出高表达的ACTA2，以及其他5种CAF标记(FAP、PDPN、DES、THY1或S100A4)中的任何一种高表达时，新诊断的GBM患者的生存恶化。
在GBM中缺乏CAFs的主要论点是，除了血管中有少量CAFs外，大脑中没有成纤维细胞。然而，由于有证据表明，其他肿瘤中的CAFs来自骨髓来源的前体，CAFs可能存在于GBM中似乎是合理的。事实上，研究已经确定了在GBM中表达与CAFs相关标记的细胞。作者首先对胶质母细胞瘤标本进行连续胰蛋白酶化处理，得到具有CAF形态和单细胞转录组谱的细胞，这些细胞缺乏拷贝数变异(CNVs)。在12例胶质母细胞瘤患者的单细胞RNA-Seq中鉴定出无CNVs和高CAF评分的细胞。伪时间重建显示，未成熟的CAFs演化为亚型，成熟的CAFs表达ACTA2。空间转录组证实CAF接近间充质胶质母细胞瘤干细胞(GSCs)、内皮细胞和M2巨噬细胞。CAFs被GSCs趋化吸引，CAFs使GSCs富集。通过将受体的表达映射到它们的同源配体，确定PDGF和TGF-β是GSC对CAFs的影响的介质，骨桥蛋白和HGF是CAFs诱导的GSC富集的介质。CAFs通过产生结合巨噬细胞TLR4的EDA纤维连接蛋白变体来诱导M2巨噬细胞极化。
