肺癌耐药机制的多组学分析
肺癌是一种高风险恶性肿瘤。非小细胞肺癌(NSCLC)中表皮生长因子受体(EGFR)的突变使EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)成为一个有吸引力的治疗选择。然而,患者通常会对EGFR-TKI产生耐药性并影响肿瘤的免疫浸润,导致患者生存不良。而其分子变异尚不完全清楚,需要进一步研究。今天小编给大家分享一篇2022年2月2日发表在Journal of Inflammation Research(IF:6.922)上的文章,看看这篇文章是如何利用多组学分析来研究肺癌的耐药机制的吧!
研究背景
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,约 80% 的肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。晚期 NSCLC 的治疗效果并不理想,但是有研究发现EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)在无进展生存期和缓解率方面优于化疗。TKI和化疗联合使用可能会进一步提高肺癌的总体生存率。然而,患者在服用 TKI 约 9 到 14 个月后会出现耐药性。虽然已经发现了一些与耐药相关的改变,但1代或2代 EGFR-TKI的耐药机制(吉非替尼、阿法替尼等)仍不完全清楚。因此,迫切需要一些新的生物标志物来预测EGFR-TKI耐药性,并促进临床实践中的最佳治疗选择。
肿瘤微环境中与癌症相关的免疫细胞浸润可能导致肿瘤生长、转移和治疗抵抗。 EGFR-TKI可以调节EGFR突变的NSCLC患者的肿瘤浸润免疫细胞,治疗后的肿瘤浸润CD8+淋巴细胞的数量显著降低。 这种变化可能与EGFR-TKI耐药有关,并为免疫检查点抑制剂等后续治疗提供线索。
因此,本研究旨在通过生物信息学分析来探索是否存在与第一代和第二代EGFR-TKI耐药、免疫细胞浸润和SCLC转化相关的差异表达基因(DEGs)。并且为克服对EGFR-TKI的耐药性提供新的见解。研究工作流程如图 1 所示。
图1:研究流程图。
结果
TKI抗性差异表达基因(DEGs)的鉴定
作者在三套GEO数据集中一共识别出107个EGFR-TKI抗性versus EGFR-TKI敏感性的DEGs(图2A)。
图2
DEGs的GO和KEGG通路富集分析
结果表明,DEGs主要富集于细胞粘附、细胞外基质组织、正向调控GTPase活性、负向调控细胞增殖和生物过程的细胞信号转导。细胞成分在细胞外泌体、质膜、细胞外间隙、细胞外区域和质膜的整体成分中显著富集(图2B-a)。而DEGs的KEGG通路分析显示,它们与细胞粘附分子、病灶粘附、PI3K-Akt信号通路、T细胞受体信号通路等相关(图2B-b)。
DEGs的蛋白质互作网络(PPI)
作者利用STRING数据库构建DEGs的PPI网络,并在Cytoscape中可视化。利用MCODE提取了四个关键模块; 基因之间的相关性越大,圆圈越大,颜色越深(图2C)。作者发现在厄洛替尼和吉非替尼耐药谱中CD44和FYN的表达均降低,而在阿法替尼耐药谱中升高。
Hub基因的表达与生存分析
接下来,作者分析了Hub基因在GEPIA上的表达水平。与正常组织相比,RAB25、ERBB2、SPP1、CDH1、ESRP1、ITGB4在肺腺癌组织中的表达水平显著升高,ZEB1、FYN的表达水平显著降低(图3A)。与高表达的SPP1和ITGB4相比,低表达的SPP1和ITGB4在LUAD和LUSC患者中与更好的总生存相关。另一方面,与低表达相比,同时高表达的SPP1和ZEB1与LUAD和LUSC患者的总生存期较差相关(图3B)。因此,作者认为SPP1对NSCLC的生存具有重要意义。
图3
SPP1在泛癌组织中的表达及预后潜力
接下来,作者研究了SPP1在泛癌中的表达。SPP1在多种肿瘤组织中表达明显高于其同源正常组织(图4A)。根据组织芯片对SPP1蛋白的染色,SPP1主要位于细胞质中。HPA数据库结果显示,肺腺癌肿瘤细胞中染色为中度,正常肺组织细胞中是低染色(图4B)。作者还比较了EGFR突变体、野生型肺腺癌和TCGA正常样本中SPP1的表达。与其他两种类型相比,EGFR突变型肺腺癌中SPP1的表达水平显著升高(图4C)。
图4
根据SPP1的表达水平,作者将EGFR突变的肺腺癌患者分为四组:0-25 %组,25%-50%组,50%-75%组和75%-100%组 (图5A)。其中,最低表达组的DSS最长。25%-50%组和50%-75%组的中位生存时间分别为3.8年和3.2年(图5B)。3年ROC曲线的AUC为0.762(图5C)。因此,SPP1的表达水平可能是EGFR突变型肺腺癌的预后因素。
图5
EGFR突变/野生型和TKI耐药群体的免疫景观
作者通过TIMER数据库进一步分析了与肺腺癌预后hub基因表达相关的免疫细胞浸润程度。 发现SPP1的表达与巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润呈正相关(图 6A)。 xCell 结果显示,与野生型相比,具有 EGFR 突变的肺腺癌患者的 CD8+ T 细胞和 CD4+ Th2 的丰度较低(图 6B)。与低表达相比,SPP1 高表达的肺腺癌患者的巨噬细胞 M1 和 CD4+ Th2 细胞较多,而 CD8+ T 细胞较少(图 6C)。这些结果可能表明 SPP1 可以调节肿瘤免疫耐受和免疫逃逸。
图6
免疫浸润景观如图 7A 所示。在图 7B 中,两类免疫能力(抗肿瘤免疫和促肿瘤抑制)呈正相关(R=0.5438,P<0.001)。作者还发现效应记忆 CD4 T 细胞、NK T 细胞、MDSC(髓源性抑制细胞)和 Th2 T 细胞中度或高度相关(图 7C)。作者在每种免疫细胞中分别比较了厄洛替尼敏感和耐药样本之间的差异。发现与敏感组相比,耐药组中的 CD8+ T 细胞和自然杀伤细胞较少,而 CD4+ T 细胞则更多(图7D)。
图7
SPP1与免疫细胞在肺腺癌中的预后分析
作者根据相关免疫细胞富集或耗尽的肺腺癌亚组中SPP1的表达进行了预后分析(图8A)。研究发现无论B细胞和巨噬细胞浸润水平如何,SPP1高表达的LUAD患者预后明显较差。提示SPP1可能是不同免疫浸润LUAD的有效预后指标。
泛癌组织中SPP1与TMB/MSI的共表达
作者发现PD-L1 (CD274)与SPP1之间呈现正相关(图8B)。此外,作者通过对SPP1表达和TMB/MSI的分析发现,SPP1不仅在LUAD中与TMB和MSI密切相关,还与其他肿瘤相关。在DLBC、THYM、SARC、ACC和PRAD中,SPP1的表达与高TMB相关(图8C)。另一方面,在LUAD和LUSC中SPP1与MSI呈负相关。在结肠癌(COAD)、肾上腺皮质癌(ACC)、肉瘤(SARC)、直肠癌(READ)和睪丸癌(TGCT)中,SPP1与MSI呈高相关性(图8D)。
SCLC转化共表达RNA-miRNA网络
由于SCLC转化也是EGFR-TKI耐药的原因之一。作者比较了SCLC和TKI耐药的DEGs,发现有42个基因在两种基因图谱中共同表达。CD44、MUC1、ESRP1、SPP1和ZEB1均为SCLC和TKI耐药的中心基因(图8E)。作者还发现hsa-miR-495-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-181a- 5p和hsa-miR-125a-3p通过疾病miRNAs网络与SCLC和NSCLC均相关。同时,5个hub基因被预测为这些miRNAs的靶基因(图8F)。
图8
甲基化预后风险模型的建立和评价
接下来,作者比较了正常与LUAD患者SPP1表达及DNA甲基化情况。与正常组织相比,LUAD中SPP1表达较高,启动子甲基化水平较低(图9A)。SPP1启动子的高甲基化代表基因表达降低。Cox比例风险模型包括5个中心基因(CD44、MUC1、ESRP1、SPP1和ZEB1)的CpGs。单因素和多因素分析显示,LUAD患者SPP1 CpG cg00088885和CD44 CpG cg20971158与OS显著相关(图9B和C),作者发现,z-score较低的患者通常比z-score较高的患者有更好的预后(图9D-a)。根据多因素比例风险回归模型,将患者分为高危组和低危组,发现低危组生存获益更好(图9D-b)。
图9
TKIs敏感性与SPP1相关
利用Cell Miner数据,作者获得了60种不同人类癌细胞的SPP1表达水平。大多数癌细胞的Z值低于0,即SPP1高表达,对药物具有耐药性。研究发现当SPP1基因表达时,除肺癌之外,乳腺癌、胶质母细胞瘤、结肠癌、黑素瘤等其他类型的癌症也对TKIs具有耐药性。
SPP1在EGFR突变型肺腺癌及癌旁组织中的表达水平
最后,作者收集了13个LUAD组织和8个癌旁组织,检测SPP1在EGFR突变LUAD中的表达。qRT-PCR分析显示,与相邻正常组织相比,EGFR-突变LUAD组织中SPP1表达明显升高(P=0.0188)(图9E)。
结论
综上所述,EGFR-TKI耐药是肺癌靶向治疗的一个关键问题。该研究的结果表明,SPP1上调可能诱导对第1代和第2代EGFR-TKIs的耐药性,并且SPP1可能被视为TKI治疗的独立预后生物标志物。此外,SPP1的高表达可能促进抗肿瘤免疫细胞浸润,在这种情况下可以考虑ICIs治疗。同时,SPP1和CD44的DNA甲基化可能是肺腺癌患者的独立预后因素。此外,5个hub基因可能通过调控EGFR-TKI耐药的肿瘤干细胞促进LUAD向SCLC的转化。
参考文献
1. Wang, Z., Zhang, L., Xu, W., Li, J., Liu, Y., Zeng, X., Zhong, M. and Zhu, Y. (2022) The Multi-Omics Analysis of Key Genes Regulating EGFR-TKI Resistance, Immune Infiltration, SCLC Transformation in EGFR-Mutant NSCLC. J Inflamm Res, 15, 649-667.