单细胞是目前炙手可热的话题，目前关于各类疾病的单细胞数据分析文章数不胜数，生信人也一直在推出与之相关的分析思路。今天小编再和大家分享一篇这个月新鲜出炉的一篇12+文章，发表在CLINICAL CANCER RESEARCH（IF: 12.658）。高级别浆性卵巢癌(HGSOC)是卵巢癌中死亡率较高的一种表型，一般发现时已到晚期。小编今天和大家介绍的这篇文章就详细描述了临床早期和晚期原发HGSOC肿瘤上皮细胞发育等级，并鉴定了EMT的特性。结合湿实验鉴定了TIGIT阻滞剂在卵巢癌中的治疗价值。

背景：

我们都知道卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，而高级别浆性卵巢癌(HGSOC)约占所有卵巢癌死亡率的80%。由于症状不明确，这种恶性肿瘤只有20%的病例可以在早期阶段被识别出来并成功治疗。患者预后较差，即使在治疗后，HGSOC也经常因化疗耐药而复发，总体5年生存率为31%。

HGSOC有几个特点。其中之一是上皮-间充质转化(EMT)过程，这是卵巢癌侵袭和转移以及化疗耐药的主要机制。激活EMT转录程序的HGSOC患者预后较差。另一个特点是肿瘤的异质性，其特征是肿瘤微环境。已有很多工作在分析HGSOC的肿瘤微环境。一种调节TME的方法是通过调节免疫细胞行为，PD-L1已被研究用于卵巢癌的免疫治疗，但效果有限。一个主要原因是PD-L1只在大约1.3%的卵巢上皮癌患者中表达上调，这表明这种方法不能适用于大多数卵巢癌患者。因此，通过scRNA-seq揭示HGSOC不同阶段的细胞特征是非常有益的，它为开发针对特定疾病阶段的合适的免疫治疗提供了更准确的信息。

结果解读：

原发HGSOC肿瘤和非恶性卵巢的单细胞图谱分析

作者对12例未接受治疗的患者卵巢细胞进行了深入的scRNA-seq分析，其中包括7例HGSOC患者和5例年龄匹配的非恶性卵巢患者（图1 A）。肿瘤细胞33,264个，非恶性细胞26,060个。图1 B和C主要展示了细胞的UMAP图和各类细胞的marker基因。然后作者使用KEGG和GO注释每个细胞群的功能特征。作者将细胞群与临床分期等肿瘤特征联系起来。随着肿瘤分期的进展，T细胞的比例逐渐降低（图1 E）。

图1

不同阶段肿瘤的上皮细胞特征

用R包INFERCNV分析每种细胞类型的体细胞拷贝数变异(CNV)，并确定CNV大于0.05且CNV相关性大于0.5的恶性上皮细胞。总共收集了14,636个卵巢上皮细胞，并将其分为12个不同的簇（图2 A,B）。然后应用CytoTRACE预测这些上皮细胞的分化状态，鉴定出HGSOC中的静止干细胞。大多数负责免疫检查点抑制的配体基因在肿瘤Ⅰ期富集，但在肿瘤晚期显著减少。PD-1和CTAL-4配体基因CD274 (PD-L1)和CD80/86 (B7-1/2)在HGSOC各个阶段的表达水平均较低。

接着作者进行伪时序分析。在基因表达相似性的基础上分成11个细胞簇，并被投射到HGSOC basic, stage 2, 和stage 3的伪时序过程中，并做了通路富集。作者发现沿着这个轨迹，簇1细胞在stage 3的基因特征被表征为特定的功能通路，包括PI3K-AKT信号通路、松弛因子信号通路、细胞凋亡和Rap1信号通路。还表达了一组EMT相关基因。

38个EMT标记物在HGSOC细胞与非恶性对照细胞中差异表达。为接着使用TCGA和GEO数进行生存分析NOTCH1、SNAI2、WNT11、和TGFBR1四个基因与不良结果显著相关（图2 F）。免疫荧光分析进一步证实了其他EMT标记基因CDH1和VIM在HGSOC组织中的存在，结果表明有一组强大的细胞具有潜在的EMT功能（图2 G）

图 2

基质间充质干细胞的多样性及CAF的特征

接着作者查看了成纤维细胞，成纤维细胞聚集成了14个细胞簇。非恶性成纤维细胞分为三个亚群（图3 A,B）。在恶性成纤维细胞中，mCAF是HGSOC肿瘤中的主要CAF。mCAF标记基因的高表达与较差的患者预后相关。染色显示晚期HGSOC的mCAF对CAF标志物a-SMA、vientin和COL3A以及mCAF标志物COL10A和MMP11呈阳性反应（图3 F）。作者为了验证mCAF是否具有促EMT特性，做了实验验证。CAF/卵巢癌细胞(A2780或OVCAR3) Transwell共培养系统中，间充质生物标记物如ZEB1、vimentin和Snail蛋白水平上调，肿瘤细胞侵袭增加，说明这些mCAF具有某些促EMT特性(图3 G,H)。

图3

巨噬细胞M1增多，HGSOC早期预后良好

接着作者又将巨噬细胞重新聚类，其中包含M1、MDSC和M2这些比较经典的巨噬细胞。

然后作者在HGSOC组织中检测巨噬细胞与其他免疫细胞类型相互作用的能力。单核细胞、B细胞、T细胞和NK细胞的迁移程度在肿瘤晚期减弱，表明巨噬细胞失去了对其他免疫细胞的吸引力。相反，许多代表巨噬细胞分泌生长因子的基因在肿瘤晚期显著诱导(图4C)。这些结果表明，巨噬细胞在这一过程中经历了恶性转化。在早期stage 1，巨噬细胞有很强的招募免疫细胞的能力， stage 1可能更适合调节肿瘤免疫反应(图4C)。

图4

图5

浸润性CD8+ T细胞状态是HGSOC TME中跨隔室相互作用形成的

除了巨噬细胞外，HGSOC肿瘤中淋巴细胞的特征和分布也与非恶性组织相比有所不同。免疫组织化学证实HGSOC和非恶性卵巢组织中有浸润性淋巴细胞的存在(图5A)。由于T细胞系携带CD8A基因浓缩(图1C)，作者通过CD8A抗体的IF分析证实了它在HGSOC肿瘤中的存在(图5B)。将CD8A+ T细胞重新分组为9个簇，而这些簇在组织中的分布有所不同。

作者重点研究了HGSOC组织中丰富的两种细胞类型，包括CD8+ T_RM和CD8+ T_EX细胞。图5E显示CD8+ T_EX细胞数量在早期较高，但在晚期较少。CD8+ T_RM细胞在早期HGSOC肿瘤中发挥局部免疫保护作用。生存因子的表达，如IL15、IL17和NOTCH配体，这些已知决定T_RM细胞的形成和持久性。其中IL15在HGSOC来源的恶性上皮细胞中表达，并诱导CD8+ T_RM细胞和CD8+ T_EX细胞的形成。除上皮细胞外，HGSOC肿瘤中的M1巨噬细胞主要表达CXCL9和CXCL10，通过CXCL9/CXCL10-CXCR3相互作用招募CD8+ T_RM细胞(图5G)。CD8+ T_RM细胞的signature与改善患者生存显著相关。

TIGIT阻滞剂在卵巢癌发生中的作用

免疫共抑制受体TIGIT调节抗肿瘤CD8+ T细胞反应，在我们的研究中CD8+ T_EX细胞也高表达TIGIT。那么TIGIT是否有助于卵巢癌的生长？作者进行了实验验证，给8只雌性C57BL/6小鼠皮下注射ID8细胞。8周后，接受抗TIGIT或同型相合对照抗体治疗(图6A)。抗TIGIT治疗的小鼠显示出肿瘤负荷的减少，如肿瘤生长缓慢、肿瘤体积和肿瘤重量降低。TIGIT阻断显著抑制肿瘤中TIGIT+ -CD8+T细胞的频率(图6 F,G)。这些结果表明，抗TIGIT抗体对CD8 T细胞的TIGIT中和作用可减轻ID8荷瘤小鼠的肿瘤负荷。

图6

总结：

这篇文章从HGSOC单细胞图谱入手，描绘了HGSOC在早期或晚期的生态系统格局，重点是它与TME的异质性。从不同角度分析了恶性上皮细胞、基质细胞、巨噬细胞、T细胞的功能及细胞间的相互作用。作者主要发现了四个EMT基因模型，可以预测HGSOC患者预后；mCAF增强卵巢癌细胞侵袭的能力以及抗TIGIT治疗的潜在治疗价值。