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今天分享的文章“基于MVI相关基因的肝细胞肿瘤预后模型的鉴定和验证 Identification and Validation of a Prognostic Model Based on Three MVI-Related Genes in Hepatocellular Carcinoma”，这篇文章于2022年发表（Int J Biol Sci , IF 10.75)。

微血管浸润( MVI)是指显微镜下鉴定的tumor侵犯血管，与tumor血道转移密切相关，是HCC肝内或远处转移，术后复发和不良预后的独立危险因素。目前仍没MVI相关分子标志物指导肝细胞癌诊断和治疗。作者探索了新的MVI(微血管侵犯)相关生物标志物，并建立了预测HCC预后的风险评分模型，可以为HCC患者个性化治疗提供基础。

一、背景

肝细胞癌是世界上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，发病隐匿，易复发和转移，由于缺乏有效的预测和治疗策略，预后往往较差，即使经过治愈性治疗，许多HCC患者仍会在5年内出现肿瘤复发。因此，迫切需要开发新的预后评估方法来预测患者的临床预后。

微血管浸润(MVI)是指显微镜下可见血管腔内内皮细胞排列的肿瘤细胞团。肿瘤细胞可存在于肝门静脉或肝静脉，是肝内或远处转移的潜在因素，并可促使术后复发，MVI是一个独立的组织病理学预后因素，与HCC患者在所有阶段的生存相关，还是术后早期复发和生存的关键因素和重要指标。近年来，虽然MVI在肝癌治疗选择和预后评估中的临床价值越来越受到重视，但由于MVI的诊断主要基于术后病理检查，目前仍没有推荐的MVI相关分子标志物来预测HCC的预后，限制了MVI在指导肝癌诊断和治疗中的应用。

在本研究中，作者探索了新的MVI相关生物标志物，并建立了预测HCC预后的风险评分模型，旨在为HCC患者提供合适的治疗方案。术前准确预测MVI，有利于医生在做出更合理的、个性化的手术范围选择术后随访策略制定，实现基于肿瘤生物学行为的个体化治疗，有望改善患者的预后。

二、方法

1.数据采集和预处理

收集了两组HCC RNA-seq数据。HCC的全基因组mRNA表达和临床病理信息作为训练队列从（TCGA LIHC下载）。共收集了95例MVI癌组织，210例无MVI癌组织和58例与临床数据相匹配的正常组织。于国际癌症基因组协会（ICGC LIRI-JP）下载验证队列。

2.TCGA队列中差异表达MVI相关基因的鉴定

有或没有MVI的癌组织分别用于与正常组织的差异分析。将DEG（具有MVI的癌组织与正常组织）中的差异基因作为MVI相关的差异表达基因。

3.Go和KEGG分析

将153个MVI相关基因应用于GO和KEGG途径富集分析。

4.HCC的预后signature开发和评估

基于训练集构建预后signature，然后在验证集中验证其预测性能。首先进行单变量Cox比例风险回归分析确定了预后相关基因，以评估训练集中MVI相关基因与OS之间的相关性。利用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）惩罚Cox比例风险回归来减少模型的基因并限制解决过拟合问题的复杂性。逐步Cox回归分析用于确定用于构建风险模型以预测HCC患者的预后。将中位风险评分设置为临界值，将患者分为高风险组和低风险组。Kaplan–Meier生存曲线用于低危组和高危组之间的生存比较。此外，建立了时间依赖性受试者工作曲线（包括1年，3年和5年生存率）来反映signature的敏感性和特异性。

5.signature的临床特征

应用Wilcoxon检验分析风险评分与临床特征（年龄，性别，阶段，等级和分化等级）的关联，并且使用相同的方法将signature应用于具有不同临床特征的患者亚组，以区分低风险和高风险病例。

6.识别构造signature的独立预后作用

使用Cox回归模型方法进行了多变量分析，以验证其独立于后价值。对具有不同临床特征（包括年龄，性别和分期）的患者的生存率进行亚组分析，以进一步评估特征的预后表现。

7.预后基因signature中基因的外部验证

基于验证组，构建Kaplan-Meier曲线来验证基因signature的预测价值，多变量Cox分析评估基因signature在验证组中的独立预后作用。

三、结果

1.MVI阳性和MVI阴性HCC组织中的差异表达基因

比较MVI和非MVI组中上调和下调的DEG（与非tumor组织相比），得到差异表达 MVI相关基因(MVIRGs)，用于后续建模。

MVIRGs的功能分析：主要参与血管内皮的生长和微管的聚集，并且主要参与代谢相关途径、tumor转录障碍和DNA复制途径。（图1）

2.预后模型的构建和识别

单因素Cox筛选出与与预后相关的MVIRG，基于这些MVIRG进行LOSSO和Cox回归，构建基于MVI的预后模型，最后选择三个关键的MVIRG（DBF4、ARG2和SLC16A3）构建模型（图2）。

3.三种MVIRGs的表达与HCC患者临床参数之间的相关性。

为了进一步验证该模型，作者分析了三种MVIRGs的表达与HCC患者临床参数之间的相关性。KM曲线显示，DBF4和SLC16A3基因的高表达与HCC患者的低OS显着相关,DBF4高表达、SLC16A3高表达与HCC的tumor分级存在显着相关性(图3)。

4.分析模型计算的风险评分与临床数据之间的相关性

高风险评分与肿瘤分级、分期、T分期显着相关；多元Cox显示风险评分和分期是OS的独立危险因素（图4）。

5.使用附加数据队列(ICGC)确认预后模型

将ICGC队列中的HCC患者分为低或高风险组，KM分析显示两组之间存在显着差异；多因素Cox分析还显示，风险评分和分期是HCC患者预后的独立危险因素，验证了预测模型具有良好的预测价值（图5）。

6.临床组织样本的验证

HCC组织和成对的相邻组织相比，显示与3个MVIRGs（DBF4、ARG2和SLC16A3）相对应的特征蛋白在肿瘤组织中染色更强烈，阳性区域更多（免疫组化）；HCC样本中三种MVIRGs（DBF4、ARG2和SLC16A3）的表达高于相邻组织（qRT-PCR）；随访数据进行分析，MVIRGs高表达者RFS和OS更低（图6）。

7.列线图模型的构建与识别

将常规临床参数引入并构建列线图模型，c-index为0.697，校准曲线验证了该模型具有良好的预测值（图7）。

四、讨论

MVI是HCC患者生存的重要预测因子，基于此，作者将MVI相关基因与常规临床参数相结合，构建了一个预后模型。富集分析表明，这些MVIRGs主要富集血管内皮的生长和微管的积累，主要通过代谢途径，肿瘤转录紊乱途径和DNA复制途径影响HCC的预后。这些结果与以前的研究结果一致。例如，MVI意味着在内皮细胞排列的血管腔中可见肿瘤细胞簇，这表明它与血管内皮的生长和微管的积累有关。此外，MVI与上皮-间质转化（EMT）密切相关，EMT涉及多种机制，包括代谢变化，转录调控和表观遗传异常，表明MVI也与这些途径有关。

用于建模的三个关键的MVIRGs（DBF4，ARG2和SLC16A3）与肿瘤密切相关，其中DBF4编码的蛋白质具有模块化结构，在DNA复制、复制检查点激活、减数分裂、有丝分裂退出、跨病变合成和组蛋白稳态中起着关键作用。过去的一些研究曾指出，较高的ASK/Dbf4表达黑色素瘤与较低的无复发生存率相关，抑制Cdc7/Dbf4激酶活性会影响癌细胞中MCM2上的特异性磷酸化位点。ARG2（精氨酸酶2）是一种蛋白质编码基因，其活性的增加通常与更晚期的疾病和不良的临床预后有关，此外与肿瘤免疫反应密切相关。最近的研究发现，ARG2的过度表达是多种癌症类型的预后不良因素，包括胰腺癌、甲状腺肿瘤、胃癌、神经母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌和急性髓系白血病（AML）。其他的一些研究发现，ARG2的缺失可导致氨的积累和肥胖相关胰腺癌生长的抑制，线粒体ARG2是CD8+T细胞功能和抗肿瘤功效的细胞自主调节因子。有趣的是，一些学者发现ARG2还具有抑癌作用。它可以通过生物合成辅因子磷酸吡哆醛的消耗和多胺毒性的增加来抑制肾癌的进展。

SLC16A3（溶质载体家族16成员3）是蛋白质编码基因。由SLC16A3基因编码的单羧酸转运蛋白4（MCT4）可以催化单羧酸的质子连接转运，单羧酸参与体内许多代谢过程，并产生抗凋亡作用。MCT4在糖酵解组织中显着存在，如缺氧癌细胞，在某些癌细胞中过表达，并在癌细胞生长和增殖中起关键作用。已有的研究表明，SLC16A3是肺腺癌患者预后不良和转移的独立指标，是胰腺癌代谢过程的关键调节因子，SLC16A3对肿瘤诊断和预后具有良好的预测能力，并且参与甲状腺癌和透明细胞肾细胞癌中SLC16A3启动子DNA甲基化和/或MCT4蛋白水平的表观遗传调控机制。

综上，这三个关键的MVIRGs（DBF4，ARG2和SLC16A3）与肿瘤及其预后密切相关，这也在一定程度上证明了选择这三个MVIRGs建立预后模型的正确性。