铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖的细胞死亡形式,目前关于铁死亡分析的发文层出不穷,生信人也一直在推出铁死亡相关的分析思路。今天小编再和大家分享一篇今年五月份发表在Journal of Cancer(IF:4.478)杂志上的关于铁死亡的胶质瘤预后文章。胶质瘤是最难治的颅内疾病之一,具有发病率和死亡率高的特点,而放射治疗在胶质瘤的治疗中起着至关重要的作用。最近有研究发现铁死亡与肿瘤细胞的放射敏感性高度相关。因此小编今天和大家介绍的文章就对胶质瘤的放射敏感性及铁死亡相关的基因进行了整合分析,并构建了预后预测模型。文章的分析方法简洁易懂但是思路很有意思,值得我们参考。
Construction of a novel radiosensitivity- and ferroptosis-associated gene signature for prognosis prediction in gliomas
构建新放射及铁死亡相关神经胶质瘤预后预测基因特征
一.研究背景
胶质瘤是起源于胶质细胞的肿瘤,是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。胶质瘤患者的中位生存期小于15个月,5年生存率小于5.5%。并且胶质瘤的发病率一直呈上升趋势。此外,由于胶质瘤的复杂性和高度异质性,目前靶向治疗效果有限,还没有有效的诊断和治疗选择。因此,迫切需要开发有效的胶质瘤诊断和治疗方法。而胶质瘤特异性生物标志物具有巨大的治疗和预后意义。因此今天介绍的这篇文章就探讨了与放射敏感性和铁死亡相关的七种生物标志物在胶质瘤预后中的作用。
二.文章摘要
文章使用来自The Cancer Genome Atlas (TCGA)的胶质瘤mRNA测序及相关临床数据,通过差异分析识别放射敏感性和铁死亡相关的差异表达基因(DEGs)。接着进行LASSO回归分析构建基于这些基因的预测模型。此外,利用中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)中的数据对结果进行验证。同时采用ROC曲线和K-M分析显示特征基因的生存预测能力。作者也进行了功能分析探索高风险组和低风险组之间的差异表达基因在胶质瘤相关生物学过程中富集情况。最后文章也分析了两组之间的免疫功能差异。
三.数据及方法
1. 数据集的获取:文章从TCGA数据库中获得的169个胶质瘤肿瘤组织和5个正常组织的RNA测序数据作为训练队列,同时也收集了临床信息。并收集CGGA数据库的RNA测序数据和相关临床数据作为验证队列。此外,从dbCRSR中下载了395个放射敏感性相关基因,并从FerrDb数据集中获得了259个与铁死亡相关的基因。
2. 识别差异表达基因:文章使用R包limma对正常脑组织和胶质瘤组织进行差异分析。采用单因素cox分析确定与总生存期(OS)相关的基因。最终识别到36个放射敏感性及19个与铁死亡相关的有预后价值的差异基因。然后构建一个维恩图来显示基因交集。进一步,利用STRING在线平台分析基因之间的交互作用,并利用Cytoscape构建可视化PPI网络。
3. 构建并验证预后模型:文章通过对放射敏感基因和铁死亡相关基因的研究,获得了7个交叉基因。然后,利用这7个基因特征采用LASSO Cox回归分析构建预后模型。接着根据中位风险评分将患者分为低风险组和高风险组。采用Kaplan-Meier分析比较两组患者的总生存期(OS)时间。使用FactoMineR R包对特征进行PCA分析。采用ROC分析评估各基因的预测精度和风险评分。此外,作者也构建了nomogram生存预测模型,用于预测1年、2年和3年的总生存期。最后,利用CGGA队列对7个基因模型进行验证。
4. 独立预后分析:作者从TCGA和CGGA数据库中提取患者的临床信息(年龄、性别、分期、IDH和MGMT)。采用单因素和多因素Cox回归分析对这些变量进行分析。
5. 功能富集分析:文章根据中位风险评分将患者分为低、高风险亚组,并筛选两组的差异表达基因。此外,使用clusterProfiler R包执行GO和KEGG分析。最后,用R包gsva 的ssGSEA测定免疫细胞浸润评分,估计免疫相关通路。
6. 实验:细胞培养、CCK-8分析和菌落形成分析、5-Ethynyl-20-deoxyuridine (EdU)测定。
四.研究的主要内容及结果
1. 识别TCGA中与放射敏感性和铁死亡相关的预后差异表达基因(DEGs)
文章在第一部分作者对TCGA数据进行分析,识别放射敏感性和铁死亡相关的DEGs,并评估其与OS的相关性,结果发现有36个放射敏感性和19个铁死亡相关的DEGs具有预后价值,其中包括7个重叠基因(图1A)。此外,作者也发现重叠基因ZEB1、CA9、HSPB1、STAT3和TNFAIP3在胶质瘤组织中表达上调(图1B)。蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络则显示STAT3是中心基因(图1C),而重叠基因的相关性如图1D所示。
2. 比较重叠基因在正常脑组织与胶质瘤组织的表达
在文章的第二部分,作者进行免疫组化染色,分析重叠基因在正常脑组织与胶质瘤组织的表达情况,结果显示ZEB1、CA9、HSPb1、STAT3、TNFAIP3基因在胶质瘤组织中的表达高于正常组织。而基因MAPK1和MAP1LC3A在胶质瘤组织中表达相对较低(图2)。这些结果与TCGA数据库中的基因表达模式一致。
3. 预后模型的构建
在这一部分作者使用TCGA数据构建了风险模型。针对上面识别的7个重叠基因。作者发现HSPB1、STAT3、CA9、MAP1LC3A、TNFAIP3的HR>1,表明它们与风险增加有关。另外两个基因MAPK1和ZEB1的HR<1,为低风险基因(图3A)。接下来作者利用LASSO Cox回归分析使用这7个基因构建了预后模型(图3B,C),并根据风险评分将患者分为高风险组及低风险组(图3D)。作者进一步通过主成分分析将不同风险组的患者聚类为两组(图3E)。研究发现高风险组比低风险组生存时间短,死亡率高(图3F)。此外,高风险组的总生存率低于低风险组(图3G)。作者也进行了ROC分析,评估了预后模型的有效性(图3H,I)。
4. CGGA数据验证预后模型
在这一部分,作者以693例胶质瘤患者为研究对象,建立了验证模型可靠性的验证集。首先,检测了7个基因在CGGA中的表达。结果发现CGGA的基因表达与TCGA一致(图4A)。进一步,作者将693例胶质瘤患者按照中位风险评分分为高风险组和低风险组(图4B),作者也发现CGGA数据集的PCA和t-SNE分析与TCGA一致(图4C和D)。高风险组患者的预后较差(图4E)。作者也使用ROC曲线分析进一步验证CGGA预后模型的预测准确性。结果显示,7基因模型具有良好的预后准确性(图4F和G)。
5. 7-基因风险模型的独立预后价值
在这一部分作者采用单因素和多因素Cox回归分析评估风险评分与临床参数(年龄、性别、IDH、MGMT和疾病分期)之间的关系。结果发现在TCGA和CGGA数据库中,risk score和年龄是OS的独立预后预测因素(表1和表2)。在TCGA数据库中,高风险基因在高风险人群中有较高的表达,如图5A热图所示。同样,CGGA数据库显示高风险基因表达相似(图5B)。
6. 功能富集分析
在这一部分作者利用GO富集分析和KEGG,基于DEGs分析其生物特征。结果发现DEGs与抗微生物体液反应、急性炎症反应、中性粒细胞迁移和急性期反应等相关(图6A)。KEGG通路分析则显示,这些基因与IL-17、细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号通路等相关(图6B)。
7. 两种不同风险人群免疫细胞浸润模式的比较
由于富集分析显示,免疫特征与辐射敏感性和铁死亡有内在联系。因此,在这一部分作者通过ssGSEA比较高风险组和低风险组的免疫细胞浸润模式。结果发现在TCGA队列中,高风险组DCs、巨噬细胞、TIL和Treg等细胞浸润率较高(图7A)。作者也发现在13种免疫通路中,TCGA高风险组和低风险组的I型IFN和II型IFN应答通路相似(图7B)。同样,CGGA显示类似的免疫细胞浸润模式(图7C和D)。
8. 胶质瘤中铁死亡与放射敏感性的关系
在文章的最后一部分,作者用铁死亡诱导剂诱变U87和U251细胞,然后用CCK-8法观察放射敏感性和铁死亡之间的关系。结果发现与对照细胞相比,经过铁死亡诱导剂处理后再进行放射处理,U87和U251细胞的细胞活力被显著抑制(图8A, B)。此外,文章也进行了实验来评估铁死亡诱导剂的放射敏感性。结果发现铁死亡诱导剂处理的U87和U251细胞对放射更敏感(图8C-F)。同样,EDU检测在U87和U251细胞中也显示了类似的结论(图8G-J)。
到这里这篇文章的主要内容就介绍完了,文章将放射敏感性与铁死亡相结合,基于相关基因构建了胶质瘤预后预测模型。文章主要的方法包括差异分析,功能富集分析,LASSO cox,单因素及多因素cox及ssGSEA等常用的生物信息方法。可见方法都比较基础,不过选取的角度新颖,可见一个好的课题切入点真的可以达到事半功倍的效果。