今天小编给大家解读一篇今年12月发表在Advanced Science杂志(IF: 17.521)的文章“The Single-Cell Landscape of Intratumoral Heterogeneity and The Immunosuppressive Microenvironment in Liver and Brain Metastases of Breast Cancer”。
转移仍然是乳腺癌死亡率较高的主要原因。其中,肝或脑转移患者的预后非常差,PD-1/L1免疫检查点治疗的应答率也很低。因此,迫切需要研究抗PD-1/L1耐药的潜在机制,为这些患者制定更有效的免疫治疗策略。作者使用单细胞RNA测序的44473个细胞描绘了整个肿瘤生态系统。剖析了乳腺癌肝脑转移瘤内的异质性和免疫抑制微环境。
为了破译乳腺癌肝和脑转移肿瘤微环境中的细胞结构,作者对转移病灶进行了单细胞RNA测序。然后,无监督聚类分析,确定了具有相似表达模式的主要细胞簇(图1b-e)。进一步进行了多重免疫荧光染色,确认乳腺癌肝脏和脑转移组织中的细胞亚群(图1f,g)。
为了评估乳腺癌肝和脑转移病灶中的免疫抑制微环境,检测了每个细胞亚群中免疫检查点分子的表达(图2c)。发现LAG3, TIGIT, CD96, 和KLRB1在T细胞中的表达高于PDCD1。相应的免疫检查点配体CD274和PDCD1LG2在肿瘤微环境中的癌细胞或其他浸润细胞中几乎不表达。其他免疫检查点配体NECTIN2、LGALS3、和LGALS9在癌细胞或其他浸润细胞中高表达(图2d)。这些结果表明PD-1受体和PD-L1/2配体对可能不是乳腺癌肝和脑转移的主要免疫检查点信号通路分子。因此,靶向LAG3-LGALS3和TIGIT-NECTIN2可能是治疗乳腺癌肝和脑转移的有效策略。
接下来,用InferCNV法区分肿瘤细胞和正常上皮细胞。在乳腺癌、肝和脑转移瘤识别了13个主要的癌细胞亚群(图3a-c)。为了研究来自多个样本的癌细胞之间的共同表达模式,建立了一个meta-cluster算法。确定了六种不同细胞状态和生物学功能的常见表达程序,包括增殖维持、转移激活、免疫逃避、应激抵抗、代谢重编程和促进炎症(图3d,e)。进行相关性分析识别出三个显著的共存程序对以及九个相互排斥的程序对(图3i)。TOP表达的程序基因KLF5可能成为抑制乳腺癌转移的潜在靶点。KLF5抑制剂可能成为未来抑制乳腺癌转移的有效药物。
根据肝转移和脑转移的差异表达基因,分别识别了7个和5个癌细胞亚群(图3j)。利用hallmark信号通路进行富集分析,探索每种细胞的潜在生物学功能和相关的信号通路(图3k,l)。
乳腺癌在很大程度上是由基因拷贝数的变化驱动的。推断的CNV图谱显示了肝和脑转移乳腺癌组织中病变间和病变内的异质性(图4a-c)。在每个患者的亚克隆中都发现了多个规范的(CNV百分比大于90%)和非规范的(CNV百分比小于90%)CNV,这些CNV在癌细胞进化的细胞群体的亚克隆中被发现(图4d)。癌细胞亚群c8_TOP2A、c9_HMGB2、c12_MKI67和c13_TK1主要处于循环状态,而c1_TCN1、c2_CD74、c3_CD24、c5_CEACAM6和c10_SAT1主要处于静止状态(图3g,h)。Monocle2和RNA velocity对癌细胞进行了轨迹分析还剖析了与癌细胞状态转变有关的基因模式的变化(图4i,f,j,k)。接着,作者评估了每个癌细胞群的干性(图4l,m)。此外,还研究了免疫检查点配体在每个癌细胞亚群中的表达。最有希望的免疫检查点治疗靶点CD274(PD-L1)和PDCD1LG2(PD-L2)在每个癌细胞群体中的表达水平较低(图4n,o)。另外两个免疫检查点配体NECTIN2和LGALS3几乎在所有的亚群中都有高表达。这些表面蛋白有望成为未来肝脏和脑转移乳腺癌治疗的免疫靶点。
之后,作者分别对T细胞和B细胞进行重组,确定了13个T细胞和先天淋巴亚群(图5a,b)。在四个CD8+T细胞中2个cluster高表达免疫检查点分子TIGIT、LAG3、CD96。B细胞重新聚集后,确定了四个主要亚群 (图5c,d)。CD4+T细胞表现出相对高水平的共刺激分子,包括ICOS和TNFRSF4,这对CD8+T细胞的细胞毒性刺激很重要(图5f,g)。CD8+T细胞高表达GZMB、GZMK、和GZMH等细胞毒基因。数据还显示,这些CD8+ T细胞亚型表达T细胞衰竭相关抑制受体,包括LAG3、TIGIT和CD96,表明这些CD8+ T细胞在乳腺癌肝和脑转移的初始激活步骤后就衰竭了(图5f,g)。CD8_T_cells_c1_GZMK和CD8_T_cells_c4_IFIT3的功能紊乱得分显著高于其他两个集群。此外,CD8_T_cells_c1_GZMK簇在脑转移癌中的功能紊乱评分高于肝转移癌(图5h,i)。
GO和KEGG分析了每种类型细胞潜在的生物学功能和相关的信号通路(图5j,k)。为了追踪CD8+T细胞的分化,进行了伪时序分析。CD8_T_cells_c1_GZMK簇的终末状态最多,伪时序得分最高,揭示了CD8_T_cells_c2_ZNF683和CD8_T_cells_c3_KLRB1簇处于中间状态(图5l)。在B细胞的伪时序轨迹分析中,Plasma_cells_MZB1簇处于最末期,具有最高的伪时序分数(图5m)。接下来,检测了CD8+T细胞亚群中免疫检查点受体的表达,发现LAG3、TIGIT、CD96、a d KLRB1(CD161)的表达高于PDCD1(PD-1)(图5n-p)。
CellphoneDB预测了癌细胞和免疫细胞之间相互作用。Treg细胞与其他细胞群体的相互作用最多,表现出与癌细胞的强烈相互作用(图6f)。癌细胞通过CXCL10-CXCR3配体-受体对招募了CD4_T_Cells_c2_CXCL13、CD8_T_Cells_c1_GZMK、CD8_T_Cells_c4_IFIT3、NK_Cells_KLRD1和T reg_Cells_FOXP3簇(图6g)。参与细胞间通讯的其他重要配体-受体对如图6h所示。
髓系细胞可分为20个簇(图7a-d)。单核细胞形成两个簇:Mono_c1_VCAN和Mono_c2_FCN1。TAMs有12个簇,可分为M1巨噬细胞、M2巨噬细胞和增殖性巨噬细胞。M1-TAMs与炎症因子相关,包括CCL2/3/4、CXCL3和TNF,在肿瘤微环境中募集T细胞、未成熟DC和NK细胞。M2-TAMs是促进肿瘤的巨噬细胞,高表达MRC1、CD163。此外,M2类TAMs的免疫检查点分子PD-L1、PD-L2、LGALS3、LGALS9的表达均高于M1类TAMs。分析了TAM成熟的轨迹,并确定了TAM状态转换中涉及的基因表达模式的变化(图7f-h)。
DC由四个簇组成:常规DC、耐受树突状细胞和浆细胞样树突状细胞。cDCs是成熟的DCs,可以激活CD8+T细胞和其他抗肿瘤免疫反应,并且高表达共刺激因子、MHC II类分子和促炎细胞因子(图7i)。LAMP3-positive tDCs是树突状细胞的一个免疫抑制亚群,它们高水平表达几种阴性免疫调节因子,包括IDO1,CCR7,LGALS3,LGALS9,和NECTIN2(图7i,k)。GO和KEGG探索每种细胞类型的潜在生物学功能和相关的信号通路(图7j)。根据CellphoneDB分析,肿瘤微环境中,TAMS与癌细胞和其他髓系细胞的相互作用最多(图7l)。
在间质间隔中发现了三种主要的细胞类型:CACs、ECs和MCs(图8a-d)。CAF被聚为四个亚群;ECs分为四个亚群;MCs可分为五个亚群(图8g)。主成分分析和diffusion map揭示了CAFs_c2_DCN的两种不同的演化轨迹,最终发展为炎症性CAF簇(图8h)。动脉内皮细胞、静脉内皮细胞和肝窦内皮细胞由毛细血管内皮细胞发育而来,参与转移灶的动态血管生成过程(图8i)。Mural_cells_c2_COL1A1细胞发育成两个分支,且这些分支中的Mural_cells_c4_MYH11和Mural_cells_c5_RGS5簇具有最高的伪时序分数,代表最分化和成熟的MC(图8j)。
接下来,检查了免疫检查点配体在每个癌细胞亚群中的表达。几个免疫检查点分子在三种基质细胞亚型中高度表达,包括LGALS3,LGALS9,NECTIN2,和TNFRSF14(图8k)。根据CellphoneDB分析,CAFs_c2_DCN, ECs_c1_GJA5,和Mural_cells_c2_COL1A1分别是CAF、ECs和MC与癌细胞相互作用最多的细胞。
不同的CAF亚群有不同的生长因子分泌模式(图8l)。提示CAF可产生VEGFRA/B,与内皮细胞上的血管内皮生长因子受体结合,促进血管生成。基于细胞生长因子和受体对,构建了CAF和癌细胞的调控网络。CAFs_c2_DCN亚群通过FGF2/7-FGFR3/4和IGF1-IGF1R信号通路促进癌细胞生长(图8m)。特别是,RGS5+肿瘤相关成纤维细胞簇被发现,并证明通过分泌Periostin和Biglycan来负调控转移性乳腺癌的免疫过程。
驻留细胞(微胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、肝细胞等)是脑或肝转移微环境不可缺少的组成部分,参与形成独特的定殖生态位和免疫环境。共鉴定了13个细胞群,包括小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、少突胶质细胞前体细胞、肝细胞和胆管细胞(图9a-e)。小胶质细胞Microglials_c1_CCL4通过分泌趋化因子如CCL3/4在肿瘤微环境中募集T细胞、未成熟DC和NK细胞,从而促进免疫应答。Microglials_c2_LGALS1表达高水平的Galectin-1,可能通过CD8+T细胞排斥形成免疫抑制的微环境。此外,免疫检查点基因SELPLG和LGALS3在小胶质细胞中高表达,而FGL1、NECTIN2、和LGALS3在肝细胞和胆管细胞中高表达(图9f-h)。
在本研究中,作者对肝和脑转移的乳腺癌样本进行了高分辨率分析,确定了不同的主要细胞类型,包括癌细胞、淋巴细胞、髓系细胞、基质细胞和器官特异性驻留细胞。分析每个细胞团的分子特征、调节因子、动力学和功能,探讨它们在转移性肿瘤进展和免疫逃逸中的作用。在癌细胞中鉴定出六种不同细胞状态和生物学功能的共同表达程序,包括增殖维持、转移激活、免疫逃避、应激抵抗、代谢重编程和促进炎症。总之,该研究揭示了肝和脑转移性乳腺癌的瘤内异质性和免疫抑制肿瘤生态系统,这为深入了解免疫检查点治疗抵抗的机制提供了信息,并为这些患者开发精确的免疫治疗策略提供了信息。