每年约有15万人死于膀胱癌，其中约有70%-80%的患者为非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）。目前，已经开发了多种治疗NMIBC的方法但是很多患者对治疗无效。因此，鉴定NMIBC的治疗靶点和预后因子十分重要。今天就给大家介绍一篇发表在eBioMedicine（IF：11.205）研究NMIBC预后因子的文章“YAP1 activation is associated with the progression and response to immunotherapy of non-muscle invasive bladder cancer”。这篇文章中作者重点关注在肿瘤发生发展中十分重要的基因YAP1。作者通过UC3-siYAP1细胞和NMIBC队列数据鉴定YAP1相关的基因特征，结果表明YAP1激活与高危NMIBC患者的特征和免疫治疗反应有关。

流程图：

结果：

1.筛选膀胱癌细胞系进行分析和验证

首先作者分析了MCF10A乳腺上皮细胞系的RNA-seq数据集并筛选2151个与YAP1过表达相关的基因。使用这些基因对MCF10A数据集进行水平聚类共鉴定到2个亚组（图1A）。随后，在4个细胞系中分析与YAP1激活有关的基因（图1a和1b）。与细胞系RT4相比而言，基因YAP1，CYR61，CTGF和TEAD2在细胞系UC14，T24和UC3中的表达水平升高，而基因FGFR3的表达水平显著降低（图1c）。转染YAP1-S127A后，细胞系RT4和UC14细胞系中CYR61,CTGF和TEAD2的表达水平升高而FGFR3的表达水平降低。转染siYAP1后，细胞系UC3和T24细胞系中，CYR61，CTGF和TEAD2的表达水平显著降低而FGFR3的表达水平增加。以上结果表明，细胞系UC3适合进行下一步实验研究YAP1表达后下游基因的表达趋势。

2.根据YAP1激活情况将NMIBC患者分为亚组

作者使用转染siYAP1的UC3膀胱癌细胞系的RNA-seq数据集鉴定到549个YAP1失活有关的差异表达基因，包括50个最显著差异表达基因。将这50个差异基因与UROMOL队列数据结合并进行K-means分析。其中siYAP1-转染细胞和YAP1失活患者聚为一类而siCon-转染细胞和YAP1激活患者聚为一类。然而，这50个基因仅能表明YAP1在细胞实验条件下被激活而不是与NMIBC患者相关的生物学特征。因此，作者使用t检验评估UROMOL队列的基因表达数据，在UROMOL数据集的YA亚组和YI亚组鉴定到976个差异表达基因。

使用这976个基因进行一致性聚类将NMIBC患者分为三组，分别为YA1，YA2和YI亚组。

3.YAP1激活与NMIBC患者的无进展生存期和膀胱内治疗（IVT）受益显著相关

在各个亚组的激活信号通路中鉴定到32个基因（图2a），与YI亚组相关的7个基因具有管腔乳头特征，与YA1亚组相关的10个基因参与DNA损伤和修复通路，与YA1和YA2亚组相关的6个基因参与上皮-间质转化和TGFβ通路激活。许多高危膀胱癌患者，如T1期和高级别，被纳入YA1亚组。此外，UROMOL队列的第2类被细分为YA1和YA2亚组。（图2a）。KM分析表明YA1亚组的进展率高于YA2和YI亚组（图2b）。多因素分析表明，YA1亚组无进展生存期的重要指标包括分期，分级和在UROMOL队列中的976个基因的signature。IVT会显著影响YA1亚组的无进展生存期（图2c）而不会影响YA2和YI亚组（图2d和2e）。

4.验证YAP1激活对膀胱癌患者的预后价值

作者结合Lund和Korean两个队列的NMIBC患者的基因表达和临床数据创建新的队列验证YAP1激活与患者预后的相关性。与上述结果一致，NMIBC高危患者被纳入YA1和YA2亚组。YA1和YA2亚组患者的进展率显著高于YI亚组。多因素分析表明YA1亚组无进展生存的重要指标包括分期，分级和976个基因的signature。

5.实验验证YAP1激活

接下来，作者使用YAP1基因敲除实验研究基因YAP1对UC3细胞增殖和活力的影响，并进行体外验证。作者主要使用两种siRNAs分别为siYAP1#1和siYAP1#2，生成了YAP1的转录水平和蛋白水平均降低70%的细胞。结果表明，与转染scRNA细胞相比，siYAP1转染的细胞存活率、增殖形成、侵袭性和迁移率均有所降低。此外，CCNA2，TEAD2，CTGF，CYR61，SMAD3和SMAD6在UC3细胞系中的表达水平有所改变。此外，CTGF，CYR61和CCNA2的蛋白水平有所降低。以上结果表明，在稳定条件下研究表型变化和基因表达水平变化是合理的。使用稳定转染shRNA-YAP1的UC3细胞系（shYAP1），生成YAP1转录水平和蛋白水平均降低的细胞系（图3a）。与shNTS细胞相比，shYAP1细胞的存活率、集落形成、侵袭性和迁移性均降低（图3b和3c）。在shYAP1中，YA1和YA2亚组的相关基因表达水平降低而YI亚组相关基因表达水平升高（图3d）。此外，CTGF，CYR61，E2F1和FOXM1蛋白水平有所降低（图3e）。然而，将YAP1载体转染到shYAP1细胞后，亚群相关基因的表达水平有所恢复（图3f）。以上结果表明，YAP1基因下调表达会抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移，并且与YA1和YA2亚群相关基因的表达有关。

6.与免疫治疗反应相关的综合分析和临床特征分析

接下来，作者综合分析IMvigor210数据集和UROMOL数据集研究YAP1激活如何影响免疫治疗的反应。基于代表每个亚组的32个选定基因，之前的基因表达谱分析是一致的（图4a）。KM分析表明，接受PD-L1免疫治疗的YA1亚组患者生存期有所延长（图4b）。随后，作者研究各个亚组和客观缓解率（ORR），其中YA1亚组的ORR高于YA2和YI亚组（图4c）。

在YA1亚组中免疫细胞和肿瘤细胞的PD-L1蛋白相对高表达（图5a和5b）。YA1和YI亚组的肿瘤突变负荷（TMB）具有显著差异（图5c）。基于TCGA分型，大部分管腔型，基底型和神经元型包括在YA1亚组中，管腔浸润亚型包括在YA2亚组中，管腔乳头亚型被纳入YI亚组（图5d）。在Lund分型中，基因组不稳定（GU）亚型在三个亚组中比例类似，YA1亚组主要包括基底/SCC样和尿基B亚型，YA2亚组主要包括浸润亚型，YI亚组主要包括尿基底A亚型（图5e）。UROMOL队列的第2类被分为YA1和YA2亚组，而UROMOL队列的第1类和第3类被纳入YI亚组（图5f）。此外，大多数NMIBC高危患者被纳入YA1亚组（图5g和5h）。以上结果表明，基于这976个基因对TCGA和UROMOL数据集进行综合分析，可以研究YAP1激活如何影响MIBC患者的预后。

结论：

总的来说，作者鉴定到NMIBC的三个亚组并研究YAP1激活，YAP1激活在不同亚组患者的进展中具有显著差异。作者的研究为NMIBC患者接受手术后各种治疗反应的生物学决定因素提供额外见解，有助于通过划分不同患者亚组进行精准治疗。