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小编今天给大家解读一篇最近发表在Journal of Thoracic Oncology杂志（IF: 20.121）上的文章,题目是“Single cell analysis reveals transcriptomic features of drug tolerant persisters and stromal adaptation in a patient-derived EGFR-mutated lung adenocarcinoma xenograft model”。
靶向治疗需要终生治疗，因为停药会导致肿瘤复发。复发主要是由在细胞毒性药物作用下存活的少数耐药持久性（DTP）细胞亚群驱动的。在肺癌方面，DTP的研究主要是通过细胞系模型进行的。作者使用一种由表皮生长因子受体(EGFR)突变驱动的肺腺癌(LUAD)患者来源的异种移植瘤(PDX)进行了体内DTP研究。每天用EGFR抑制剂erlotinib治疗荷瘤小鼠5-6周后，肿瘤明显缩小，并产生DTP，通过全外显子组、批量群体转录组和单细胞RNA测序(scRNA-seq)进行分析。DTP可能起源于特定的预先存在的癌细胞亚群，其激活了特定的耐药途径。TKI治疗诱导DTP表现出这些通路的更强激活，同时将主要的先前存在的CAF群体转换到一种新的状态，这可能进一步促进DTP的生存。
厄洛替尼缩小PHLC137 PDX肿瘤，治疗1个月后进入最小残留病(MRD)状态(图1A)。由于证实MRD含有尚未发展到获得性耐药的DTP，当TKI治疗停止时，肿瘤会重新出现，并对药物产生反应。基础治疗和厄洛替尼治疗的DTP肿瘤显示粘液分化，表明DTP没有去分化。DTP肿瘤还表现出间质纤维化增加(图1B)，类似于新辅助EGFR TKI治疗后EGFR突变的肺癌，并显示Ki67表达降低(图1C,D)。
DTP和未经治疗的（BL）肿瘤在外显子突变、拷贝数改变或亚克隆结构(图2A,B)方面没有差异。因此，在厄洛替尼治疗后，没有出现遗传上不同的耐药亚克隆。识别了DTP中相对于BL的1051个DEG。(图2C)。使用Hallmark基因集的GSEA发现，下调的DTP DEGs在细胞周期、E2F和MYC活性方面富集，与DTP Ki67表达降低一致。上调的DTP DEGs在NF-кB通路激活方面富集最多(图2D)。上调最多的DTP基因是APOE(图2C)。APOE在脑和肺损伤期间上调，以防止由EGFR TKIs触发的氧化损伤。MUC5AC也与其他几种黏蛋白一起上调，支持DTPs维持或增加粘液谱系分化。此外，几种乙醇脱氢酶(ALDHs)有较高水平表达，这可能有助于DTPs耐受TKI产生的活性氧。为了确定DEG是否转化为可以标记DTP状态的蛋白质表达差异，对两个上调的DTP基因ECM1和AKAP12进行了IHC。这两种蛋白在DTP肿瘤细胞中的表达高于在BL肿瘤细胞中的表达(图2E和F)。
scRNA-seq分析了约3000个高质量的BL癌细胞，但从显微镜下的DTP肿瘤中只获得了94个高质量的细胞，这与它们的MRD性质一致。结合BL和DTP数据显示了7个簇(图3A,B)。簇6包括77%的DTP和4%的BL细胞。由于该聚类包含了大部分的DTPs，将簇6中的122个BL细胞标记为DTPL。在伪时序分析中，肿瘤细胞沿三部分轨迹分布(图3C)。所有DTPs都只出现在单一状态的末端，表明处于稳定状态。大多数DTPs和DTPL细胞在同一状态的末端紧密聚集在一起，而一些DTPL细胞位于骨干路径上，提示存在过渡状态。DTP或DTPL细胞的伪时序值最高，BL细胞的伪时序值最低，说明从BL到DTPL再到DTP的过渡过程。该分析支持DTPL细胞不仅与DTPs相似，而且可能是DTPs的前体(图3C)。
在簇6内，99%的DTP和97%的DTPL细胞处于G1，而其他簇中，95%的DTP和48%的BL细胞处于G1(图3D)。因此，DTPL细胞共享DTPs减少的周期分布。为了进一步研究DTPs和DTPL细胞之间的相似性，从scRNA-seq数据中鉴定了相对于BL细胞的DEG。对于DTPL细胞，相对于簇6之外的BL细胞，鉴定出524个DEGs; 70%的DTPL DEGs也是DTP DEGs(图3E)，这进一步支持了它们的相似性。
接下来，探索了其他肺癌模型和患者DTPs中升高的基因。据报道，来自Hallmark基因集的脂肪酸代谢(FAM)和活性氧(ROS)特征在奥希替尼处理PC9细胞后产生的DTPs中更高; 两种特征评分在簇6之外的BL细胞中低，而在DTPs细胞中最高(图3F)。使用包含EGFR和其他驱动突变的肿瘤细胞队列，使用各自的激酶抑制剂治疗，肺泡signature和一组629个基因，与治疗naïve肿瘤(RD标记)相比，在残留疾病中差异过表达。这些基因在BL细胞中表达量低，在DTPL细胞中表达量居中，在DTPs中表达量高(图3F)。总的来说，DTPs和DTPL细胞在G1细胞周期阶段相似地富集，共享多个基因和signature表达谱，据报道在其他DTPs或治疗后残留肿瘤中过表达，并通过轨迹和伪时间分析提示其发育相关。
通过scRNA-seq，在DTPs中富含的top DEG是ECM1，并被证实在一小部分BL肿瘤细胞中在蛋白质水平上表达(图2E,F)。免疫组织化学方法检测了ECM1在治疗初期切除的具有EGFR突变的原发LUAD中的表达。所有病例中有71%有ECM1的表达，其中大多数有罕见或局灶性表达。
使用常见的“高置信度”DTP DEG，带有Hallmark基因集的GSEA仍然将NF-кB确定为最高上调途径，而E2F、细胞周期和MYC仍然是DTP中最高下调途径(图4A)。通过量化另一个由EGFR突变的肺癌细胞中的直接靶点组成的NF-кB信号的表达，证实了NF-кB的发现。这一特征在DTP细胞中最高，在DTPL细胞中居中，在BL细胞中最低(图4C)。
接下来，对ENCODE和ChEA转录因子靶基因集进行了GSEA。在活性只有一个方向变化的因子中，GATA2是DTP和DTPL细胞中上调最多的转录因子(图4D,E)。据报道，GATA2至少部分通过激活NF-кB来促进肺癌的生存。MYC是DTP和DTPL细胞中最高下调的转录因子，E2F在这两个群体中也显著下调(图4D,E)。在DTP/DTPL细胞中，NFE2L2/NRF2活性被预测上调，从而促进了周期PC9 DTPs的产生和EGFR TKI耐药性的产生。NRF2的结果得到了证实，即A549细胞中由直接NRF2靶标组成的signature在DTP中最高，在DTPL细胞中居中，在BL细胞中最低(图4F)。
为了研究不同EGFR突变的肺癌PDX之间治疗初期肿瘤细胞群体和DTP异质性的潜在相似性，在另一个TKI治疗的PDX模型上进行了scRNA-seq分析。PHLC164具有EGFR外显子19缺失和T790M突变，并与奥西美替尼治疗50天以产生DTP(图5A)。对BL和DTP细胞的scRNA-seq联合分析表明，49%的DTP位于第3簇，包含少量BL细胞亚(图5B)，代表DTPL细胞。PHLC164 DTPs和DTPL细胞中至少有24%和18%的DEG分别与PHLC137中相应的群体共享(图5C)。PHLC164 DTP DEGs也富集了与PHLC137 DTP DEGs相似的上调和下调通路(图5D)。最后，在患者样本中鉴定的PHLC164 DTPs具有残留疾病(RD)和肺泡特征的表达升高，并且可以确认PHLC164 DTPL细胞具有肺泡特征的中间表达(图5E)。因此，用不同的TKIs治疗的不同EGFR突变肺癌PDX模型在已有的DTPL细胞和DTPs中显示出一些相似性。
DTP肿瘤间质独特的癌相关成纤维细胞(CAF)表型。
CAFs是一种异质间质细胞，可促进癌症的肿瘤进展，并与TKI治疗后复发有关。TKI治疗如何改变treatment-naïve与DTP癌细胞中的CAF尚不清楚。使用scRNA-seq数据比较PHLC137模型中BL和DTP肿瘤中的CAFs(图6A)。在两种肿瘤状态下，大约3900个小鼠细胞被标记为成纤维细胞(图6B)。CAFs聚集成4个亚群(图6C)，簇4和5在状态之间的共享比例相似。簇2在BL中CAF亚群最多，但在DTP肿瘤中几乎完全消失。相反，簇0在BL状态下是次要亚群体，在DTP状态下是优势亚群体。
簇2为肌成纤维细胞“myCAFs”，是treatment-naïve癌症中描述最一致的CAF群体，由TGF-β信号通路诱导。簇4的特征描述了myCAF在伤口愈合和T细胞渗透中的活跃作用。簇5是iCAF，由于其分泌的细胞因子，具有更多的促炎表型。
通过伪时间分析(图6E)，簇2、簇5和簇0 CAF在轨迹结束时被视为不同的位置，这表明它们代表明确的稳定状态。簇2和簇5中的状态可以与这些簇的top signature所描述的CAF相关。簇4可能是不同的中间激活状态。
对分泌信号因子的分析显示，每个CAF簇都表达促生长和免疫调节因子，簇4、簇5和簇0也分泌促血管生成信号，簇2产生TGF-β配体(图6F)。虽然Fgf7在簇0 CAF中上调，但在DTP癌细胞中ERK活性并没有增加。免疫调节因子是cluster特有的，突出了每一种CAF亚型可能发挥其独特的免疫调节形式。
IL6-JAK-STAT3信号在0簇CAFs中活跃，DTP基质细胞中约40%的磷酸化-STAT3，比BL基质细胞增加了两倍。同样，DTP癌细胞中的STAT3磷酸化相对于BL癌细胞增加(图7A,B)。IL6已被证明可以促进EGFR突变肺癌细胞系对TKI治疗的生存。总之，这些研究结果表明，由簇0 CAFs分泌的Il6可以激活PHLC137 DTPs中的STAT3，促进其在体内的生存。
TKI治疗期间，簇2和簇0 CAF之间的显著转变表明这些群体相互转换。首先从PHLC137 BL和DTP肿瘤中提取CAF培养物。发现与这些CAF的体内转录图谱一致。TGF-β刺激BL CAF进一步增加了簇2 CAF标记的表达(图7B)，与簇2的表型类似于TGF-β调节的MyCAF。相反，用IL1α刺激BL CAF，诱导簇0标记的表达(图7B)。这些发现与用人类CAF进行的类似实验平行。然而，总体而言，数据支持由TGF-β和NF-кB激活剂调节的CAF可塑性和相互转化机制。最后，测试了在EGFR突变的肺癌细胞和CAF的共培养中，厄洛替尼治疗是否可以将簇2 CAF转化为簇0表型。在厄洛替尼治疗12天后，簇0表型更强大的标记之一IL6的表达增加了12倍，而簇2标记Lrrc15的表达下调(图7C)。因此，TKI治疗前和治疗后的主要CAF群体可能反映了一种单一类型的CAF群体，其表型受TGF-β和NF-кB激活剂的调节，以及它们的调节受TKI的存在或缺失(图7D)。
DTP肿瘤保持了未经治疗的(BL)肿瘤的基因组克隆结构，但表现出减少的增殖。scRNA-seq鉴定了一种罕见的BL细胞亚群(DTP样细胞，DTPL)，与DTP细胞在转录水平上相似，并且在DTP细胞中上调的通路具有中等活性。此外，肿瘤中TGF-β激活的肿瘤相关成纤维细胞(CAF)被富含IL6的CAF群体所取代。体外实验表明，这些群体的相互转换依赖于TGF-β和NF-кB信号的水平，后者受TKI的存在调节。DTP显示有NF-кB和STAT3信号增强的迹象，这可能促进了它们的生存。
