大家好！今天给大家介绍一篇发表在Genomics, Proteomics & Bioinformatics (IF:6.409)上的鉴定人视网膜色素上皮中与衰老相关的蛋白质和功能改变的（Identification of age-associated proteins and functional alterations in human retinal pigment epithelium）文章。视网膜色素上皮（RPE）具有滋养和支持神经视网膜等功能，对老年性视网膜病变的发病机制具有重要意义。然而，REF在衰老过程中分子变化仍然不是十分清楚。在本篇文章中，作者对10到67岁的18例样本中分离人类原发性RPE（hRPE）细胞并进行定量蛋白质组学分析。结果表明RNF123和RNF149相关的泛素化在保护hRPE细胞免受衰老过程中氧化损伤方面发挥重要作用。此外，在衰老的hRPE细胞中，细胞内和分泌蛋白中凋亡信号通路上调而内质网组织下调。下面，就让我们看看这篇文章的具体分析内容吧~

流程图：

结果：

1.本研究整体流程

首先，作者根据眼睛捐赠者的年龄将样本分为三组，分别为青年组4例（Y，10-18岁），中年组7例（M，35-41岁）和老年组7例（O，55-67岁）。分离hRPE细胞并培养两代。为了鉴定不同分组下hRPE细胞系之间细胞内和分泌蛋白质组的变化模式，作者使用TMT-10plex进行定量蛋白质组学。在hRPE细胞的第三代传代时，提取和消化细胞内和分泌蛋白并使用TMT标记。对样本使用TMT-10plex随机标记来消除批次效应并进行LC-MS。

2.hRPE细胞的蛋白质组特征

在7921个细胞内蛋白中鉴定到74502条肽段，平均覆盖度为25.1%。在3843个分泌蛋白中鉴定到27930条肽段，平均覆盖度为17.4%（图1A）。其中有5735个细胞内蛋白和2455个分泌蛋白在所有样本中进行定量。质控结果表明，细胞内蛋白的变异系数（CV）不超过2.55%而分泌蛋白的CV不超过3.22%，丰富度前10的细胞内蛋白分别为PLEC,AHNAK,MUH9,FLNA,VIM,FLNC,PRKDC,ACTG1,MACF1和DYNC1N1（图1B），而分泌蛋白分别为COL1A1,COL1A2,C3,FN1,FLNA,ACTN4,FLNC,FBN1,AGRN和LAMB1（图1C）。

为了进一步描述hRPE细胞的特征，作者进行了PANTHER和GO亚细胞定位分析。PANTHER分析表明，细胞内蛋白包括代谢物相互转化酶，核酸结合蛋白和蛋白质修饰酶（图1D）。GO亚细胞定位分析表明，大多数细胞内蛋白属于膜，细胞核和囊泡。此外，作者还量化了93种视网膜中未鉴定到的蛋白质（图2E）。

3.衰老过程中hRPE蛋白质组学特征的变化

为了阐明hRPE分子功能变化与衰老之间的关系，作者使用蛋白质聚类分析鉴定与衰老相关亚型（图2A），共鉴定到10个簇（C1-C10）。其中，簇C1,C5和C6蛋白富集通路在Y和M组相对稳定而在O组发生显著变化。在O组中，C1相关通路上调而C5和C6相关通路下调。因此，簇C1,C5,C6和C7蛋白富集的通路可能与衰老相关RD的病理过程密切相关。

为了进一步分析不同阶段（O vs Y，M vs Y和O vs M）之间的关系并解释衰老过程对hRPE的影响，作者进行GSEA分析。O vs Y和O vs M具有类似的富集模式（图2B），说明这些蛋白质在O期发生了明显变化，这可能是RPE相关疾病在老年时容易发病的原因。此外，在衰老过程中hRPE细胞在某些过程下调而在其他过程上调。

4.衰老相关蛋白和功能

为了鉴定hPRE细胞中与衰老相关的蛋白，作者计算不同分组中蛋白的皮尔森相关系数。将r阈值设置为0.5，P阈值设置为0.05，在Y vs O分组下有46个蛋白上调和35个蛋白下调（图3C）。随后，作者对这些蛋白进行GO和KEGG富集分析。GO分析表明FMNL3,COL18A1,ATPIF1和ERAP1等下调蛋白有助于血管生成（图3D），RNF149,RNF123,FBXO9,PCNP和MALT1等上调蛋白参与蛋白质泛素化（图3D）。PRKCA,PRKCI,BCAR1,GNAI2和TIGB3参与RAP1信号通路（图3E）。

5.RNF123,RNF149和蛋白质泛素化可以保护RPE在衰老过程中免受氧化损伤

为验证作者蛋白质组学数据结果的可靠性并解释RNF123,RNF149，泛素化蛋白与衰老之间的关系，作者进行蛋白质印记分析（WB）。作者发现RNF123,RNF149和泛素化蛋白水平会随着年龄的增长而增加（图3A和3B）。为验证RNF123,RNF149和相关泛素化蛋白在RPE衰老过程中的作用，作者分析使用梯度浓度的氧化损伤诱导剂（H2O2和D-gal）处理的ARPE-19和HEK293T细胞。WB结果表明，RNF123,RNF149和泛素化蛋白的水平随D-gal和H2O2浓度的增加而增加。然而，这种现象会被一种天然抗氧化剂叶黄素逆转（图3C和3D）。接下来，作者使用具有一定浓度梯度的H2O2处理Y组和O组的hRPE细胞。CCK8活力结果表明，O组的hRPE细胞更易氧化损伤。WB结果表明，氧化损伤与蛋白质泛素化上调有关。为了研究RNF123,RNA149与蛋白质泛素化水平之间的关系，结果表明，RNF123和RNF149过表达会显著增加ARPE-19和HEK293T细胞中蛋白质泛素化水平。这种现象同样可以使用叶黄素逆转（图3E和3F）。为研究RNF123和RNF149在RPE细胞中的功能，作者研究RNF123和RNF149过表达猴ARPE-19细胞对氧化损伤的耐受性。活力分析表明，过表达RNF123和RNF149后，ARPE-19细胞对H2O2的敏感性降低（图3G）。由于，活性氧（ROS）的积累是细胞氧化损伤的指标。因此，作者定量H2O2处理的ARPE19细胞的ROS水平。结果表明，过表达RNF123和RNF149会到时ROS水平显著降低（图3H）。总的来说，ARPE-19细胞中过表达RNF123和RNF149 会抑制H2O2诱导生成的ROS水平。HEK293T细胞的结果与之类似。此外，衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是细胞衰老的重要标志物。作者进一步定量过表达RNF123和RNF149后H2O2处理的ARPE-19细胞中SA-β-gal水平的变化。结果表明，SA-β-gal水平在H2O2处理的细胞中显著增加（图3I），然而过表达RNF123和RNF149后SA-β-gal水平降低。以上结果表明，过表达RNF123和RNF149会减少细胞在衰老过程中的氧化损伤，这与泛素化水平变化有关。因此，RNF123和RNF149和相关蛋白泛素化可能在保护RPE免受氧化损伤中发挥重要作用。

6.衰老相关的分泌表型和蛋白质

为鉴定与衰老相关的分泌表型，作者对分泌蛋白进行聚类分析，共鉴定到9个簇（C1-C9）（图4A）。簇2中蛋白质富集的通路随年龄增长而上调，这些通路与凋亡信号通路有关（图2D）。然而，簇C9中蛋白富集的细胞组分组织和ER组织通路随年龄增长而下调。随后，作者进行皮尔森相关性分析，有38种蛋白上调和16种蛋白下调（图4B）。

7.与衰老相关的分泌蛋白网络改变

作者对分泌蛋白进行WGCNA分析，共鉴定到15个模块（图4C），相关性分析表明M7和M11模块与衰老正相关，M9与衰老负相关。随后，作者对模块M7,M9和M11进行KEGG和GO富集分析。KEGG富集分析表明，M7和M11富集于RNA相关通路，泛素介导的蛋白水解，核苷酸切除修复等（图4D），M9富集于丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢和精氨酸生物合成等通路。GO富集分析表明，M7的核糖体结构组分，M11的翻译调节活性及M7和M11的结合相关过程会随着年龄的增长而上调。然而，酶活性，NAD结合和辅酶结合会随着年龄的增长而下调。

8.衰老过程中hRPE细胞中特异性改变的分泌蛋白

由于，分泌蛋白的特异性改变可能对衰老过程中细胞间通讯十分重要。因此，作者接下来分析了hRPE细胞中共有的细胞内蛋白和分泌蛋白，共有2067个。其中有147个分泌蛋白发生显著变化，包括IMPAD1,CPD,RMDN3,MGAT1,MYEF2和PAPOLA（图5A）。使用Cytoscape中ClueGo软件对特异性改变的分泌蛋白进行功能富集分析，共鉴定到108个显著富集的GO 功能（图5C）。这些生物学过程可能在RPE的细胞间通讯中发挥重要作用。

总结：

RPE在滋养和支持神经视网膜方面发挥重要作用，在衰老相关的视网膜病变发病机制中起到关键作用。在这篇文章中，作者全面描述了hRPE细胞的蛋白质组和分泌组特征。此外，作者还揭示了hRPE在衰老过程中的变化并鉴定与衰老相关的蛋白质及其相关功能。总的来说，作者的研究描述了人类RPE在衰老过程中的详细分子特征，有助于未来RPE和相关视网膜疾病的研究。