今天给大家带来一篇液-液相分离调节基因与消化道肿瘤临床相关性的生信分析，作者利用TCGA数据表征了LLPS调节因子在3种消化道肿瘤类型（如COAD，STAD和ESCA）中的表达分析。研究思路设计精美，这就给各位解读一下！

文章“Systematic Analysis of Molecular Characterization and Clinical Relevance of Liquid-Liquid Phase Separation Regulators in Digestive System Neoplasms”发表在《Front Cell Dev Biol》，影响因子6.081分。

研究背景

1、不会混合的两种液体（如油和水）之间的分离被称为液-液相分离（liquid-liquid phase separation，LLPS）。例如，将一汤匙醋倒入水中，只需短暂搅拌即可将两种液体完全混合。但是将一汤匙油倒入水中油会聚结成小滴，无法如何搅拌也不混合。某些蛋白质的行为类似于液体，而某些液体的蛋白质却不会混合在一起。然而，关于这些液体样蛋白如何影响细胞内部的结构与行为却知之甚少。这样的蛋白质不溶解在细胞内。相反，它们可以与自身或与其它蛋白质凝结，从而使细胞能够将某些生化活性区分开，而不必将其包裹在膜结合的细胞器内。

2、苏州大学生物医学研究所的周芳芳教授和浙江大学生命科学研究所张龙教授预2021年在《Signal Transduction and Targeted Therapy》杂志上发表了题为“Liquid-liquid phase separation in human health and diseases”的综述，系统性地介绍了液相分离在人类生理状态和疾病状态下的功能作用。其中提部分介绍了LLPS如何调控转录，举文中一例：不同的转录因子，包括胚胎干细胞多能性转录因子OCT4、配体依赖性转录因子雌激素受体和酵母转录因子GCN4，均可以与共激活因子复合物Mediator形成相分离的凝聚物。凝聚物可以通过影响启动子、转录延长因子、管家基因调控细胞转录。

3、LLPS还可以影响免疫应答，T细胞受体（TCR）的信号簇可以相分离成凝聚物，TCR信号转导抑制因子CD45则被排除在凝聚体之外，以确保T细胞的活化。这些免疫反应凝聚体的形成，为干预治疗提供了潜在的新途径。

结果展示

Genetic Alterations of LLPS Regulators in Digestive System Neoplasms

消化系统肿瘤中LLPS调控因子的基因改变

作者共纳入了156个LLPS调控基因。评估了156个LLPS调节因子的突变表达分析，确定消化系统肿瘤中LLPS调节因子的突变水平。

在TCGA的COAD，STAD和ESCA队列中个体作者的突变频率很高。其中，421个COAD样本中，328个（77.91%）有LLPS调节因子突变（图 1A)。其中，突变频率最高的基因是TP53（58%），其次是BRD4（8%），ITSN1（8%），TNRC6B（10%）和FBN1（10%）（图 1A)。同时，在441个STAD样本中，296个（67.12%）具有LLPS调节剂突变（图 1C).其中，高频突变基因前10名包括TP53（0.5）、FBN1（0.1）、AR（0.07）、POLR2A（0.05）、PML（0.05）、BRD4（0.05）、AGO2（0.04）、TNRC6B（0.04）、HTR1A（0.04）和ITSN1（0.04）（图 1C)。最后，在184个ESCA样本中，172个（93.48%）具有LLPS调节剂突变（图 1E)。其中，突变频率前10名的基因包括TP53（0.87），FBN1（0.06），KPNB1（0.04），MED1（0.03），BRD4（0.03），PML（0.03），DLG4（0.02），FUS（0.02），LCP2（0.02）和NPHS1（0.02）（图 1E)。通过结合对DSN中LLPS调节因子遗传改变的分析，我们发现BRD4，FBN1和TP53在所有类型的消化肿瘤中均发生突变（图1A、C、E)。本研究还进行了LLPS基因共表达析，在所有类型的消化肿瘤均可发现TP3突变（图 1B，D，F)。这表明LLPS调节基因的突变可能会推动消化道肿瘤的进展。

Genetic Alterations of LLPS Regulators Were Related to the Progression of Digestive System Neoplasms

LLPS调控基因的改变与消化系统肿瘤的进展有关

突变特征可以反映肿瘤的病理过程。除了环境因素, 也有文献报道诸如APOBEC和DNA修复基因等体内的改变参与肿瘤细胞的基因突变。在本研究中,作者分析了APOBEC的和非APOBEC富集的COAD、STAD和ESCA样本之间的突变负荷。如图2所示, 作者发现所有LLPS调控基因的总突变负荷在APOBEC -富集的STAD样本中明显降低。作者在COAD样本中发现与非APOBEC富集的样本相比TARDBP、CBX1、SQSTM1、DDX4和TIAL1突变在APOBEC富集的样本中明显减少 (图2A)。在STAD样本中, FBN1突变受到了下调。然而, 与非APOBEC -富集样本相比, UBC突变在APOBEC富集的样本中显著下调(图2C)。对于ESCA，BRD4 *、HNRNPH1、XPO1、TP53、ESR1、IPO5、MED1和UBQLN2上的突变与非APOBEC富集的样本相比，APOBEC富集的样本中含量较高(图2E)。

此外，作者分析了COAD中LLPS调控基因的变异等位基因频率(VAF)，发现TP53、NPHS1、TNRC6B、ITSN1和TNPO1的VAF值较高(图2B)。LLPS调控基因的VAF分析显示，TP53、PML、AR、TNRC6B、ITSN1和BRD4的值较高(图2D)。最后，对ESCA中LLPS调控基因的VAF分析显示，TP53、PML、BRD4、DLG4和PTPN1可能是ESCA进展的驱动基因(图2F)。

Genetic Alterations of LLPS Regulators Were Related to the Prognosis of Digestive System Neoplasms

LLPS调控基因表达水平与消化系统肿瘤的预后相关

为了进一步证明LLPS调控基因在消化系统肿瘤中的临床重要性，作者分析了LLPS调控基因的表达水平改变与COAD、STAD和ESCA临床特征之间的关系。如图3所示，根据肿瘤TNM分期分析显示，无远处转移的M0 COAD样本中GATA2和ITSN1突变显著富集，M1 COAD样本中TP53突变显著富集，Mx COAD样本中HTR1A突变显著富集(图3A)。在STAD样本中，T1分期的样本的DYRK3、YTHDF1、HTR1A、ELN、PRNP、SUMO3、UBQLN2、CBX5、LCP2、NCK1、EWSR1、YTHDF2和SOS1突变水平显著升高。ABL1、PRNP、ESR1突变水平在T2 STAD样本中显著升高，DDX3X、TIA1、CBX2、KPNB1、DAXX、XPO1、MORC3、GATA3、ITSN1、SOS1、TNRC6B、DYRK3、PML、FBN1、ESR1、IPO5突变水平在T4/x STAD样本中显著升高(图3B)。通过ESCA样本分析，结果显示MED1突变更可能与囊性、粘液性和浆液性肿瘤有关。TP53突变更可能与鳞状细胞肿瘤相关(图3C)。

接下来，作者进行Cox回归分析，以确定LLPS基因突变与消化道肿瘤患者总生存期 OS之间的相关性。结果显示，CPEB3、SFPQ、APP、SURF6、XPO1和HNRNPA2B1突变与与COAD OS时间延长有关。通过分析STAD样本，作者发现LCP2、KPNA2、PIAS2、PML、MED1和SURF6突变与STAD 患者的OS时间延长有关。然而，没有观察到在ESCA中LLPS调控基因突变水平与OS之间存在显著相关性。

Predicting the Drug Response in Digestive System Neoplasms Based on Genetic Alterations of LLPS Regulators

基于LLPS调控因子的基因改变预测消化系统肿瘤中的药物反应

接下来，作者根据LLPS调控基因的表达水平预测了在消化系统肿瘤中的药物反应。结果显示，与转录因子结合、DNA修复、耐药性、组蛋白修饰、核激素受体、磷脂酶、蛋白酶相关的药物可能在发生对应突变的COAD(图4A)、STAD(图4B)和ESCA(图4C)患者中有较好的应答。

LLPS Regulators Were Significantly Differently Expressed in Digestive System Neoplasms

LLPS调控因子在消化系统肿瘤中表达显著不同

作者接下来利用TCGA数据库进一步分析LLPS调控基因在消化系统肿瘤中的表达水平。如图5所示，作者发现LLPS在COAD、STAD和ESCA中具有不同的表达模式(图5A)。例如，RPL23A、RPL5、NPM1、TP53、CBX2、SURF6、MYC、PRMT1、POU5F1、SYN1、RARA、SQSTM1、CBX5、CBX1、LBR、IPO5、FMR1、TIA1和SGOL1在COAD样本中均显著上调 (图5)。NCK1、MORC3、PRNP、HOMER3、UBC和PML在ESCA样品中均显著高表达 (图5A)，而ITSN1、CPEB3、TNRC6B、SYN2、DYRK3、FYN、ESR1、GATA3、LAT、GRAP2、LCP2、GATA2、MAPT、HSPB2、ELN、AR、FBN1和DLG4在STAD样品中均显著高表达 (图5A)。此外，作者还分析了LLPS调控基因在肿瘤和正常样本之间是否存在表达差异。总之，作者发现21个LLPS调控基因在COAD样本中存在差异表达(图5B,C)， 38个LLPS调控基因在STAD样本中存在差异表达(图5B,C)。26个LLPS调控基因在READ样本中存在差异表达(图5B,C)， 21个LLPS调控基因在ESCA样本中存在差异表达(图5B,C)。只有2个LLPS调控基因在所有4种消化系统肿瘤中存在异常表达，包括SYN2和MAPT (Figure5C)。如图5D所示，与正常样本相比，SYN2和MAPT在所有肿瘤样本中都过表达。

LLPS Regulators Were Significantly Related to Tumor Immune Infiltration in Digestive System Neoplasms

在消化系统肿瘤中，LLPS调节基因与肿瘤免疫浸润显著相关

新的研究表明，肿瘤免疫浸润在预测人类癌症的免疫治疗反应中起着至关重要的作用。因此，作者全面分析了在COAD、ESCA和STAD样本中LLPS调节基因表达与肿瘤免疫浸润的相关性。如图6所示，我们发现LLPS调控基因与消化系统肿瘤中的肿瘤免疫浸润显著相关(图6A , D)。例如，C6orf150与活化的树突状细胞和M1巨噬细胞显著相关(图6A)。TNRC6B与活化的树突状细胞和记忆B细胞呈正相关，与休眠NK细胞和活化的肥大细胞呈负相关(图6C)。另外，MYC、RPL5、NONO、LBR、NPM1和IPO5与DSNs中的CD4、记忆和活化T细胞最为显著地正相关(图6A, D)。GRAP2、LAT、PML、LCP2、HNRNPD和GATA3与消化系统肿瘤中的CD8 T细胞呈最显著正相关 (图6A D)。FMR1、DYRK1A、DDX3X、MAP1LC3B、TIAL1、YTHDF3、HNRPDL、NCK1、SOS1、XPO1、TIA1、MORC3和TNPO1与消化系统肿瘤中的调控性T细胞(Tregs)呈最显著负相关(图6A D)。

Construction of LLPS Regulators Signature in Digestive System Neoplasms

消化系统肿瘤中LLPS调控基因特征的构建

接下来，作者构建了一个基于LLPS调控基因的消化系统肿瘤的风险评分模型，以量化单个消化系统肿瘤患者的风险模式。LASSO回归与十倍交叉验证，以得到最优lambda值。结果显示，11个、7个和6个基因分别与CRC、ESCA和STAD的OS显著相关(图7A)、图7B和图7C)。作者基于消化系统肿瘤中这些基因的多变量Cox回归建立了一个预后模型。如图9所示，COAD的风险评分= (0.1422)*CBX2 + (0.303) *CSTF2T + (0.0738)*DLG4 + (0.3897)*FUS + (0.145)*FYN + (0.1619)*HOMER3 + (0.0388)*MAPT + (0.082)*MYC + (0.1419)*NCK1 + (0.3473)*SFPQ + (0.1166)*SYN1(图7D)。ESCA的风险评分= (0.4195)*DAXX + (0.4709)*FMR1 + (0.2345)*GATA2 + (0.0365)*IPO5 + (0.1818)*MAPT + (0.6283)*NPM1 + (0.0282)*TNPO1(图7E)。STAD的风险评分= (0.1379)*CSTF2 + (0.0593)*LBR + (0.3102)*SURF6 + (0.137)*SYN1 + (0.0395)*SYN2 + (0.0804)*YTHDF2(图7F)。然后根据整个样本签名的中位数将消化系统肿瘤分为风险评分高组和低组。结果显示，高危组的OS比低危组短 (图7D , F)。此外，作者接下来对建立的CRC、STAD和ESCA评分进行了时间依赖性ROC分析(图7G, I)。在1、3和5年OS时，CRC模型的AUC值分别为0.691、0.643和0.653(图7G)。STAD在1-、3-和5年OS时的AUC值分别为0.716、0.793和0.730(图7H)。ESCA的模型在1年、3年和5年OS的AUC值分别为0.662、0.625和0.511(图7I)。

The Levels of LLPS Regulators Signature Associated With Immune Infiltration

与免疫浸润相关的LLPS调控因子水平

很少有研究报道TME浸润免疫细胞与LLPS调控基因的关系。在本研究中，作者研究了LLPS调节基因在TME中的作用。作者利用CIBERSORT方法分析了LLPS调控因子特性中免疫细胞成分的变化，并首次系统地揭示了LLPS调控基因可能与免疫细胞浸润有显著相关性。如图8所示，结果显示LLPS调控因子签名评分与COAD中CD4 ⁺ T细胞浸润、中性粒细胞浸润、巨噬细胞浸润和髓样树突状细胞浸润水平显著正相关(图8A)。结果显示，LLPS调控基因模型评分与STAD中B细胞、CD4 ⁺ T细胞浸润、CD8 ⁺ T细胞浸润、中性粒细胞浸润、巨噬细胞浸润、髓样树突状细胞浸润水平显著正相关(图8B)。此外，LLPS调控基因模型评分与ESCA细胞中性粒细胞和巨噬细胞浸润水平呈正相关。此外，这些生物信息学分析与上述LLPS参与调节免疫信号的分析一致(图8C)。这些提示LLPS模型可能预测消化系统肿瘤对免疫治疗的反应。

Comprehensively Bioinformatic Analysis of LLPS Regulators in Digestive System Neoplasms

消化系统肿瘤中LLPS调控基因的综合生物信息学分析

接下来，作者进行了KEGG和GO分析，以揭示LLPS调节基因在消化系统中的潜在作用。KEGG分析显示，COAD中不同表达的LLPS调控基因与ErbB和T细胞受体信号通路显著相关(图9A)， ESCA中不同表达的LLPS调控基因与结直肠癌、ErbB信号通路、慢性髓系白血病、急性髓系白血病、子宫内膜癌、肿瘤转录调控失调、mRNA监测通路、化学致癌-受体激活、和RNA转运(图9B)。非常有趣的是，GO分析显示LLPS调控因子主要富集于T细胞受体信号通路、抗原受体介导的信号通路以及对T细胞激活的调控，这表明它们可能与调控COAD中的免疫应答有关(图9C)。与此同时,也观察到LLPS调控基因参与调控T细胞受体信号通路。此外，作者发现STAD和ESCA中的LLPS调控基因主要参与RNA代谢过程的调控(图9D,E)。例如，STAD和ESCA中的LLPS调控基因参与调控mRNA代谢过程、RNA剪接、miRNA结合、调控RNA结合和mRNA前结合。

Construction of LLPS Regulators Signaling Network in Digestive System Neoplasms

消化系统肿瘤中LLPS调控基因信号网络的构建

为了解LLPS调节基因如何影响消化系统肿瘤中的信号通路改变，作者构建了一个LLPS调控基因信号网络。我研究结果表明，在COAD中，LCP2、ABL1、GRAP2、NCK1和PRNP调节T细胞受体信号;FYN、CPEB3、DLG4、EIF4EBP2、PRNP、MAPT与认知记忆相关(图10A、C)。STAD中，CSTF2、PTBP1、HNRNPA1L2、TIA1、HNRNPA2B1、TARDBP和NUP98参与RNA剪接调控。KPNA2、MED1、HNRNPA2B1、TARDBP、NUP98和XPO1与核质转运和核转运的调控有关(图10B)。在ESCA中，发现FUS、HNRNPA2B1、KPNA2、GATA3、TP53、MYC、PML、CGAS、NPM1、HNRNPA1和HNRNPD与DNA代谢过程调控有关，CSTF2、PSPC1、NONO、HNRNPA3、DAZAP1、FMR1、PTBP1、HNRNPA2B1、FUS和HNRNPD与RNA剪切有关(图10D)。

总结

作者系统地分析了4个LLP调控因子，分析了这4个基因与消化系统肿瘤的预后、进展和肿瘤微环境的调控机制。此外，作者构建了一个预后模型，风险模型与患者地预后存在相关性，可以预测患者地预后。最后，肿瘤免疫分析结果显示LLPS调控基因与CD4 + T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和CD8 + T细胞的浸润水平显著正相关。