今天给大家分享一篇发表在Cell(IF: 41.584)上的文章:
Systematic discovery of mutation-directed neo-protein-protein interactions in cancer
系统性地发现与验证癌症中突变导致的新蛋白质-蛋白质相互作用
一.研究背景
基因组突变数据可提供潜在的癌症驱动基因和治疗靶点。然而,即使在同一癌症基因中,不同的驱动突变也可能在功能上不同,具有不同的临床意义。因此,将这种癌症突变信息转化到突变氨基酸水平,对于识别突变等位基因特异性靶点、生物标记物等来说至关重要。在编码可作用靶点的驱动基因中发现了一些突变,但大多数突变位于与已知药物无直接联系的基因中,或位于编码“不可抗”的基因中,如衔接蛋白或肿瘤抑制因子。这些蛋白质主要通过蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络与其他细胞成分的相互作用发挥其功能。因此,了解癌症驱动突变如何通过改变的PPI整合到细胞信号网络中,可能会导致潜在的通路干扰策略治疗癌症(图1A)。错义突变是导致肿瘤发生的常见基因组变异。突变(MUT)等位基因可能在编码的蛋白质上产生新的表位(图1A)。这种突变可能改变编码蛋白质的内在特性。这些新表位也可能产生对接位点以诱导新相互作用,或阻碍削弱现有的相互作用。这种新表位触发的差异性PPI(Df-PPI)可能指示重新连接的致癌程序,这些程序是肿瘤细胞生长和扩散失调的基础,并可能揭示治疗干预急需的肿瘤特异性分子靶点。然而,由癌基因和抑癌基因突变引发的新相互作用的范围仍有待确定。
二.研究方法
在这里,该研究建立了一个基于NanoLuc荧光素酶的生物发光共振能量转移(BRETn)差异PPI识别平台,该平台可比较筛选野生型(WT)和突变体(MUT)等位基因对应物,以检测活哺乳动物细胞中与癌症相关蛋白的差异相互作用(图1B)。该技术为定量高通量差异筛选(qHT-dS),能够从17792对潜在PPI的检查中系统地鉴定32个等位基因的差异WT和MUT相互作用蛋白。对Df-PPI数据集的分析显示,癌基因和肿瘤抑制基因的错义突变引起的相互作用广泛增加。对突变导向的新形态PPI(neo-PPI)的检测揭示了癌基因和抑癌基因突变形式的潜在替代机制和信号通路。选择BRAFV600E /KEAP1相互作用进行验证,使用一组正交分析将其提升至经验证的neo-PPI状态。该neo-PPI重定向BRAFV600E上调NRF2介导的氧化还原信号。qHT-dS平台能够在单个突变残基分辨率下加速发现Df-PPIs,所得数据集可作为生物医学界精确肿瘤学方法的资源。
三.研究结果
1、肿瘤相关基因表达文库用于PPI筛查
为了确定由基因组改变编码的复发突变残基产生的新蛋白,该研究试图建立突变残基和具有明确的癌症相关蛋白的连接,用于重点对比检查。为此,构建了一个癌症相关基因表达文库,为OncoPPi v2文库(图1C),由556个不同的人类WT蛋白编码ORF组成,以搜索驱动突变的相互作用伴侣。为了选择人类癌症突变等位基因以发现Df-PPI,建立了一组致癌突变表达载体,为OncoMut文库。对于驱动突变的比较研究,首先关注两个定义明确的癌基因和四个频繁突变的肿瘤抑制基因中的复发性突变,这些基因具有来自不同肿瘤谱系的24个等位基因(图1D)。OncoMut文库包含癌基因AKT1和BRAF的突变;肿瘤抑制因子SPOP、F-box和FBXW7和转录调节因子SMAD4和SMARCA4。
2. qHT-dS平台用于比较分析WT和MUT PPI
为了识别活细胞中的Df-PPIs,建立了一个差异筛选平台qHT-dS(图1B)。通过使用1536孔板格式的基于BRETn的超高通量PPI筛选技术实现。为了确保对qHT-dS数据进行严格的统计评估,开发了对相互作用进行比较分析的(CARINA)算法,以量化相互作用信号的强度(图2A)。将fold-over-control(FOC)数据与BRET饱和曲线的曲线下面积(AUC)值(PFOC)的p值分析相结合,进行对比研究,以确定WT和MUT的PPI(图2B-2D)。通过CARINA分析,共为每个PPI及其相应的对照组建立了55600条BRET饱和曲线。与单点蛋白质表达二元PPI映射不同,qHT-dS包含蛋白质表达的变化。当FOC≥1.2,PFOC≤0.01时,CARINA识别出50%以上的已知WT PPI,而低于1.2的FOC下限仅会略微增加筛查中检测到的已知PPI数量(图2C)。因此,FOC ≥1.2和PFOC≤0.01被用作定义统计显著性PPI的主要阈值。利用这些参数,共识别出8839个PPI(图2D)。这些PPI可作为进一步评估的候选相互作用,以确定不同的PPI。
3.确定不同PPI的优先级
为了鉴定突变驱动的Df-PPI,根据WT和MUT-PPI图谱的FOC值进行了比较分析。为了区分相互作用的获得(Go-PPI)和相互作用的丧失(Lo-PPI),计算WT和MUT-PPI曲线之间的差异以获得差异分数(DS)以及相应的p值(PDS)(图3A)。根据DS和PDS,确定了864个差异Go-PPI(DS>1,PDS<0.001)和172个差异Lo-PPI(DS<1,PDS<0.001)。应用QDS<0.01和DS ≥1.5或DS≤1.5为高严格(HS)阈值,表明WT和MUT PPI信号之间至少有50%的差异,HS-Go-PPI和HS-Lo-PPI组分别有359和13 个PPI(图3A和3B)。这372个高严格差异PPI用于评估等位基因依赖性相互作用的特异性和性质。通过对HS-Go-PPI图谱的分析,不同的基因产物,甚至同一基因的不同等位基因,在相互作用伴侣中表现出显著的差异(图3C)。例如,在SPOP和FBXW7中,发现不到10%的重叠Go-PPI伴侣发生突变。G386D与D351H SMAD4等位基因和F102C与F133V SPOP等位基因的共享伴侣比例分别为13%和30%,表现出突变特异性相互作用。令人惊讶的是,同一位点的突变以残基依赖的方式显示出不同的相互作用。例如,62%的SPOP F133L伴侣与F133V伴侣不同。由于与热休克蛋白90(HSP90)的一般伴侣功能相关,这种突变等位基因特异性相互作用不太可能发生,尽管许多疾病突变体显示与HSP90的相互作用增加。事实上,仅识别到HS-Go-PPI和HSP90已知PPI伴侣之间的小部分重叠(1.4±0.9%)(图3C)。这些结果凸显了突变等位基因介导的Go-PPIs的特异性以及在蛋白质连接性水平上潜在的等位基因依赖性肿瘤异质性。为了深入了解等位基因驱动的致癌程序,对每个伴侣的等位基因选择性进行了检查(图3D)。总的来说,35%的HS-Go-PPI伴侣与3个或更多的等位基因相互作用,通过不同的突变涉及共同的致癌通路。这些HS-Go-PPI伴侣在核心生长调节途径中发挥作用(图3E)。实验结果也显示,多种突变残基参与了常见通路,如细胞周期、PI3K/AKT/mTOR和JAK/STAT通路,为致癌基因的表达提供了机制基础功能的这些驱动突变(图3F)。此外,大多数HS-Go-PPI伴侣(65%)与一个或两个等位基因相互作用,表明这些伴侣和相应的通路可能在含有某些突变的癌症中发生特异性改变(图3D)。
4. neo-PPI候选相互作用的实验验证
为了收集进一步的实验证据以验证突变介导的差异PPIs,对HS-Df-PPI数据集进行了采样,以便在哺乳动物细胞中进行同源性BRET和GST pulldown的实验验证。总的来说,325个PPIs中有265个显示出差异结合信号,代表了82%的HS-Df PPIs(图4)。对BRAFV600E介导的neo-PPIs候选相互作用(图4A)在黑色素瘤、肺癌和结肠癌细胞中进行了检测,其中BRAFV600E定义了一个患者亚群,并进行了三次补充性分析。(i)NanoPCA分析用于确认癌细胞中接近内源性表达水平的BRAFV600E neo-PPIs,表明在A375黑色素瘤细胞和H1299肺癌细胞中分别与BRAFV600E有44和38个结合的相互作用(图4A和4C)。(ii)标记BRAFV600E的标记物用于检查其与内源性结合伴侣的相互作用。在肺癌细胞的flag-BRAFV600E免疫复合物中检测到15个内源性伴侣(图4D)。在结肠癌细胞系中进行内源性flag-V600E co-IP研究进一步证实了五种neo-PPIs(图4Ei)。(iii)利用co-IP质量抗体证明内源性BRAFV600E与VHL、BCL2L1和KEAP1在患者来源的含有BRAFV600E的癌细胞形成复合物(图4Eii)。同样,在MCF7乳腺癌细胞中检测AKT1E17K neo-PPI,在HCT116结肠癌细胞中检测SMAD4G386D PPI,并在C4-2前列腺癌细胞中评估SPOPF133L伴侣与内源性伴侣的相互作用(图4F-4H)。
5. neo-PPI候选相互作用阐述肿瘤抑制基因和癌基因突变的假说
该研究检查了已确定的肿瘤抑制蛋白和癌基因蛋白的PPI核心元素。通常认为,肿瘤抑制基因通过功能缺失突变导致肿瘤发生,从而损害其肿瘤抑制功能。出乎意料的是,Df-PPI数据显示,肿瘤抑制基因突变同时表现出Lo-PPIs和Go-PPIs以及一组不同的癌症相关蛋白,这意味着肿瘤抑制基因可能通过neo-PPI获得新形态活性。例如,SMAD4G386D与GSK3β的相互作用增强可能使SMAD4G386D获得影响GSK3β调节的Wnt/b-catenin途径的能力。SPOPF133L是一种在前列腺癌中频繁突变的肿瘤抑制因子,它不仅失去了与已知WT结合伴侣的相互作用,如BRD4和NCOA3(SRC-3),而且增强了与其他伴侣的相互作用,如c-JUN(图4H)。SPOPF133L /c-JUN neo-PPI支持以下假设,即SPOP突变可能参与c-JUN通路以驱动AP-1介导的致癌程序。qHT-dS数据还表明,致癌激酶的驱动突变,如AKT1E17K和BRAFV600E,能够与多个结合伴侣相互作用,这可能会重新连接致癌途径,并提出替代途径干扰方法(图4)。例如,该研究的筛查揭示了AKT1E17K的51个等位基因选择性结合伴侣(图4F)。AKT1E17K介导的相互作用得到了其他数据集的支持,包括与乳腺癌细胞中内源性伴侣的结合、共同的亚细胞定位以及一部分伴侣的已定义AKT1磷酸化基序的存在(图4F)。在已鉴定的Go-PPI中,E17K突变似乎增强了AKT1与DNA损伤反应(DDR)蛋白质的相互作用,如ATM和FANCC/E(图4F),这增加了AKT1E17K可能改变细胞对DNA损伤和修复的反应的可能性。AKT1E17K状态与增强的细胞对DNA损伤信号的抵抗力呈正相关,支持未来对AKT1E17K可能通过NOOPI和ATM调节DDR的假设的检验。类似地,热点突变V600E使BRAF能够与RAS /MEK信号级联之外的蛋白质伴侣相互作用。与WT对应物相比,确认了BRAFV600E的NRAS和14-3-3β的常见PPI以及MEK1的Lo-PI(图4A和4B)。、还确定了47个V600E增强的PPI候选相互作用,显著扩展了BRAFV600E突变等位基因介导的致癌通路(图4A-E)。
6. BRAFV600E与KEAP1的neo-PPI的验证
基于以上研究,假设突变的BRAFV600E产生了一个新表位,与KEAP1的亲和力增强,这可能通过调节NRF2介导的通路影响ROS反应。为了验证这一假设,通过一组互补的生化和细胞实验进一步评估了这一neo-PPI。与qHT-dS结果一致(图5A),在GST pulldown实验中,BRAFV600E显示出明显高于WT和其他BRAF突变体与KEAP1的相互作用信号(图4)。通过Venus-PCA分析(图5B),在显示细胞质定位的活细胞中,以及在内源性细胞条件下,通过对一对等基因细胞系(图5C)和一组患者来源的BRAFV600E黑色素瘤细胞系(图4E)的co-IP研究,证明了这种neo-PPI,支持其在生理条件下的存在。研究表明BRAFV600E的激酶结构域和KEAP1的KELCH结构域导致了它们的关联(图5D)。通过BLI分析纯化的蛋白质,BRAFV600E的激酶结构域(而非WT的激酶结构域)显示出与KEAP1 KELCH结构域的直接结合BLI信号(图5E)。用vemurafenib治疗BRAFV600E携带细胞以剂量依赖性方式减弱BRAFV600E与KEAP1的相互作用(图5F)。总之,这些数据有力地支持了BRAFV600E /KEAP1这一neo-PPI。
7. BRAFV600E /KEAP1 neo-PPI导向NRF2信号
事实上,BRAFV600E(而非WT)的过度表达显著稳定了NRF2蛋白(图6A和6B),增加了其转录ARE报告活性(图6C),增加了NRF2及其靶基因NQO1的蛋白水平(图6D),但没有增加NRF2 mRNA水平(图6E)。与WT细胞系相比,BRAFV600E黑色素瘤细胞系中的NRF2蛋白及其下游NQO1蛋白水平(图6G和6H)显著升高。这些数据得到CCLE数据集的支持,显示上调的NQO1 mRNA水平与BRAF的V600E状态呈正相关(图6I)。此外,用vemurafenib治疗BRAFV600E黑色素瘤细胞可降低KEAP1结合,导致NRF2和NQO1蛋白水平下调(图5F和6J)。MEK1抑制剂对KEAP1/NRF2活性没有影响(图6K)。BRAFV600E表达增加与KEAP1复合物中NRF2数量减少相关,表明BRAFV600E取代了KEAP1复合物中的NRF2(图6L)。这些结果表明了BRAFV600E诱导的KEAP1隔离模型,其中BRAFV600E通过与KEAP1的竞争结合激活NRF2,此外还有先前报道的转录调节机制。为支持该模型,KEAP1的沉默使NRF2蛋白水平对BRAFV600E状态无反应(图6F)。进一步分析了CRISPR-Cas9数据,发现BRAFV600E突变使癌细胞依赖KEAP1生存,对KEAP1敲除的敏感性增加(图6M)。因此,BRAFV600E细胞可能遗传对KEAP1控制通路的内在敏感性。
8. 化合物筛选证实了BRAF V600E突变所带来的互作上的缺陷
为了寻找利用BRAFV600E相关脆弱性的潜在治疗剂,利用一对带有V600E突变或无突变的BRAF的基因工程MCF10A细胞系进行化学筛选。利用生物活性化合物文库进行平行细胞活性筛选,发现一类醌类化合物对V600E细胞具有选择性生长抑制作用(图6N)。这一结果证实了路径分析的观察结果,该分析将BRAFV600E /KEAP1相互作用与NQO1的增强激活联系起来。因此,V600E突变的获得有可能导致NQO1功能的提高,从而提高对有毒NQO1底物的敏感性。为了验证这一论点,利用脱氧喹啉酮(DNQ)(图6O),一种有效且特异的NQO1底物,来检测其对BRAFV600E细胞存活的影响。当用DNQ处理时,BRAFV600E携带细胞对DNQ的敏感性高于WT细胞(图6P)。观察到的差异反应曲线显示,使用BRAFV600E的WM3482细胞系比使用BRAF WT和DNQ处理的CHL细胞系的敏感性显著增强(图6Q)。因此,黑色素瘤癌细胞中的BRAFV600E可能触发对NRF2-NQO1调节的细胞毒性醌衍生物的敏感性增强。鉴于BRAFV600E /KEAP1 neo-PPI可由BRAFV600E抑制剂vemurafenib调节(图5F和6J),确定vemurafenib是否能与DNQ协同抑制V600E癌细胞的生长。使用BRAFV600E突变的WM3482细胞系作为模型,与单独使用DNQ治疗相比,使用维莫拉非尼后再使用DNQ治疗显示DNQ的效力略有下降,表明vemurafenib对DNQ有负面影响(图6R)。然而,当我们用DNQ预处理细胞,然后用vemurafenib逆转治疗顺序时,观察到DNQ的效力显著增加(图6R)。在BRAFV600E突变的多个黑色素瘤细胞系中也观察到了这种有效的顺序组合效应(图6S)。因此,BRAFV600E与KEAP1的neo-PPI不仅重新连接了NRF2调节的氧化还原通路,而且还产生了对细胞毒性NQO1底物敏感性增强的细胞状态。未发现的BRAFV600E变异体定向组合策略支持对已证实的neo-PPI的未来探索,以用于机制研究和neo-PPI治疗策略(图6T)。
四、总结
总之,该研究结果支持通过突变等位基因激活的PPI重组突变驱动的致癌途径的概念。经实验验证的neo-PPI提供了产生可测试假设的基础,以进一步检验其功能意义。这种突变决定的PPI不仅可以增强我们对癌症分子重编程的理解,而且还可以揭示针对肿瘤变体介导的治疗干预机制的潜在方法,这可能适用于癌基因和肿瘤抑制基因的基因组改变。从该研究的定量筛选平台、生物信息学和实验注释以及验证性研究中获得的Df-PPI数据集和neo-PPI数据集,为科学界提供了一个有价值的资源,用于变异介导的分子相互作用研究,以加速精准医学方法。