今天给大家分享一篇2023年1月31日发表在Nature Communications （IF:17.694）上，单细胞分析揭示与肺癌分子亚型相关的成纤维细胞亚群的文章。

Single-cell analysis reveals prognostic fibroblast subpopulations linked to molecular and immunological subtypes of lung cancer

一．研究背景以及研究方法

在这里，研究者使用单细胞转录组测序（scRNA-seq）、多重免疫组化以及CIBERSORTx来鉴定了非小细胞肺癌中的三个成纤维细胞亚群:外膜成纤维细胞、肺泡成纤维细胞和肌成纤维细胞。肺泡和外膜成纤维细胞富集于正常组织，并且二者在肺腺癌（LUAD）中富集时，可改善LUAD患者总生存率。伪时间分析确定了成纤维细胞激活的三个阶段:炎症细胞因子的初始上调，应激反应信号，以及纤维胶原蛋白表达的增加。肌成纤维细胞与LUAD总生存率低相关，与上皮分化丧失、TP53突变、近端分子亚型和髓系细胞招募相关。

二．研究结果

1、从scRNA-seq数据鉴定成纤维细胞

研究者共收集6例癌旁、7例肺鳞癌（LUSC）和5例肺腺癌（LUAD）样本进行单细胞转录组测序（图1a，1b）。从中识别到间充质细胞、免疫细胞和上皮细胞群（图1c）。间充质细胞包括两个独立的细胞群:内皮细胞（VWF⁺）和基质细胞（DCN⁺和DPT⁺）（图1c）。

为了区分肌成纤维细胞与壁细胞，作者鉴定了人类肺组织中成纤维细胞和壁细胞之间差异表达的基因（HLCA;图1 e）。作者在HLCA数据集中计算了它们的平均每细胞表达量，发现这些特征可以准确地识别两类细胞（图1f, g）。然后他们在自产的数据集中检查了这些特征的表达量（图1h-j），证明在基质细胞簇中检测到了壁细胞（n=69）和成纤维细胞（n=885）。

2. NSCLC中存在三种成纤维细胞亚群

作者在6个已发表的NSCLC的scRNA-seq数据集再次进行了成纤维细胞鉴定，并且也识别到三个成纤维细胞亚群（外膜成纤维细胞、肺泡成纤维细胞和肌成纤维细胞）（图2a， 2b）。

随后对三个亚群进行差异基因与通路分析，鉴定出肌成纤维细胞上调的622个基因，其中188个基因在样本水平分析中仍然保持显著性。肌成纤维细胞亚群的标志物包括MMP11、POSTN、CTHRC1、COL1A1、ACTA2和COL3A1（图2c）。GSVA通路分析显示，这些细胞显著上调了参与产生胶原ECM相关的通路（图2d）。外膜成纤维细胞中有481个基因上调，其中73个基因在分析样本差异表达时仍然显著，包括PI16、IGFBP6、MFAP5、APOD、PLA2G2A和GSN。GSVA通路分析发现涉及PTGIS的多种通路上调，包括前列腺素和胆汁酸/盐的合成（图2d），以及补体激活通路也显著上调 （图2d）。对于肺泡成纤维细胞，差异表达分析鉴定出672个上调基因，其中78个在样本水平分析中仍保持显著性，包括MACF1、RGCC、INMT、LIMCH1、A2M和GPC3。GSVA通路分析鉴定出TRP通路上调（图2d）。

作者发现肌成纤维细胞上调了基质小体相关的多个基因，大多数是间质胶原蛋白（图2e）;肺泡成纤维细胞上调与基底膜和ECM糖蛋白相关的多个基因的表达;外膜性成纤维细胞上调多种ECM糖蛋白和蛋白聚糖（图2e）。随后他们计算了每个基质小体的模块得分，发现肌成纤维细胞显著上调间质胶原（图2f）;而肺泡和肌成纤维细胞均表现出明显增加的基底膜基因表达（图2g）。重要的是，作者发现肿瘤样本中的这三个亚群相较于正常对照样本，间质胶原蛋白表达显著增加（图2h）。并且，无论是哪种亚型，肌成纤维细胞Signature在肿瘤样本中显著上调（图2i）。与癌旁组织相比，从肿瘤样本中分离的成纤维细胞中的iCAF Signature显著下调（图2j）。

3. 不同亚型的空间分布和丰度

作者应用多重免疫组化（mxIHC）实验进行了实验验证（图3a）。mxIHC结果显示肺泡和外膜成纤维细胞在正常肺组织存在（图3b）。而在肺间质组织中也观察到AOC3 ⁺肺泡成纤维细胞（图3b），在支气管周围区域也观察到CD34⁺外膜成纤维细胞（图3b）。然后也在NSCLC的切片中证实了三个亚群的存在（图3c, d）。

作者还观察了正常、LUAD和LUSC组织样本中每个亚群体的相对丰度。与LUAD和LUSC相比，对照组织样本中的外膜成纤维细胞明显更丰富（图3e）。肺泡成纤维细胞同样在对照组组织中最多，但在一些LUAD样本中也具有一定高丰度，而在LUSC中很少出现（图3e）。相比之下，LUAD和LUSC的肌成纤维细胞丰度比对照组织显著增加，但LUSC的肌成纤维细胞丰度也明显高于LUAD（图3e）。用CIBERSORTx分析TCGA RNA-seq数据证实了成纤维细胞亚群和组织类型之间的这些关联（图3g）。然后用mxIHC进一步验证（图3f）。

4.肌成纤维细胞的伪时间轨迹分析

作者进行了轨迹推断分析，发现外膜成纤维细胞和肺泡成纤维细胞可以作为肌成纤维细胞转分化的独立起始祖细胞（图4a, b，c）。这个分化轨迹上确定了四个基因模块:祖细胞、早期激活、未完全分化和分化（图4d, e）。

相比之下，未完全分化和分化模块在伪时间内的表达趋势在对照样本和NSCLC样本之间存在差异性，转分化的中间阶段在肿瘤样本显著增加（图4f， 4g）（图4f）。随后使用REACTOME通路进行了富集分析（图4h），表明富含许多编码核糖体蛋白的基因（图4h），这是肌成纤维细胞的超微结构特征，可能表明这些细胞具有增强的蛋白质翻译能力。参与HSF1转激活的热休克家族基因（如HSPA1A、DNAJB1和HSP90AB1）在该模块中显著富集（图4h）。此外，在这个模块中也发现了氧化应激反应相关的基因（如HIF1A、GGT和SERPINE1）高表达。

作者使用mxIHC检测了HSPA1A/HSP70的表达。当将肿瘤内的细胞与肿瘤邻近对照区域的细胞进行比较时，发现每个成纤维细胞亚群的显著增加（图4i），证实来自NSCLC肿瘤的刺激比来自对照组织的刺激更能诱导热休克反应。在转分化的所有阶段，与对照组相比，肿瘤组织中的分化模块显著增加（图4g）。该模块富含参与胶原形成和ECM组织的基因（图4h），与肌成纤维细胞表型一致，上述数据表明，与对照组织样本相比，肿瘤样本中的纤维胶原蛋白上调。

5. 成纤维细胞表型的跨组织分析

研究者在PDAC、HNSCC和CRC数据集中，检验这些成纤维细胞表型在癌症类型中是否保守（图5a）。然后使用概率机器学习模型将这些细胞分类为NSCLC中确定的三个亚群（图5b, c）。这表明，在所有分析的癌症类型中，外膜和肌成纤维细胞群具有很强的保守性; 而肺泡成纤维细胞在肺癌中更特异。

然后，通过多重免疫组化实验进行了验证发现在每种癌症类型中，外膜成纤维细胞和肌成纤维细胞是主要的亚群（图5d）。此外，正如在NSCLC中发现的，与所有三种肿瘤类型的肿瘤组织相比，对照组的外膜纤维细胞明显更富集（图5e），肿瘤组织中的肌成纤维细胞更富集（图5f）。

6.多个NSCLC队列的生存分析

作者利用CIBERSORTx对多个NSCLC队列细胞比例的反卷积分析。每个成纤维细胞亚群的相对丰度被用于Cox比例风险回归模型。发现具有高肌成纤维细胞特征的患者伴有不良预后 （图6a-c）。并且，在三个验证队列中也得到了一致的结果 （图6 d）。多因素cox回归分析也显示，该特征与疾病分期和患者年龄无关（图6i）。并且，作者采用相同的方法分析，发现具有高肺泡成纤维细胞丰度的患者伴有较好预后（图6e-g）。同样，也在三个独立验证集中得到了验证（图6 h），该特征也与疾病分期和患者年龄无关（图6j）。

7. 研究与LUAD主要预后特征的相关性

根据CIBERSORTx分析结果，不同形态亚型的LUAD成纤维细胞亚群丰度差异显著（图7b），同时scRNAseq （图7c）和mxIHC （图7a, d）的结果都显示与中度/高分化（G1/G2）相比，低分化（G3）亚型肿瘤样本中的肌成纤维细胞增加。

作者在bulk RNA-seq数据集中证实了这一点，发现77%的TRU肿瘤为中度/高分化（G1/G2）， 69%的PP肿瘤为低分化（G3）。正如预期的那样，肌成纤维细胞丰度在近端增殖[PP]肿瘤中最高;而肺泡和外膜成纤维细胞在终末呼吸单位[TRU]肿瘤中最为突出（图7f）。此外，他们还发现带有TP53突变的LUAD肿瘤中肌成纤维细胞丰度增加（图7e）。

作者还使用CIBERSORTx检测了免疫细胞亚群（LM22）的丰度及其与成纤维细胞亚群的相关性，发现肺泡成纤维细胞与多种静息免疫细胞亚群相关（例如肥大细胞、CD4 ⁺记忆T细胞和树突状细胞），此外还有单核细胞和B细胞（包括记忆和naïve 亚群）。相反，肌成纤维细胞与巨噬细胞、中性粒细胞、活化的肥大细胞和活化的CD4 ⁺记忆T细胞相关（图7g）。

四、总结

总之，这项对成纤维细胞异质性的综合分析表明，肺泡成纤维细胞是肺异性的，而外膜成纤维细胞与肌成纤维细胞则始终存在于不同的组织、癌症和病理中。此外，肌成纤维细胞和肺泡成纤维细胞与LUAD的不同分子和免疫亚型相关，并且这些特征可以准确地识别LUAD高风险患者。这些发现可以改善患者分层，并给予完善肺癌成纤维细胞靶向治疗的提供了新策略。