今天给大家带来一篇成纤维细胞与胃癌免疫微环境相关的生信分析,研究思路设计精美,这就给各位解读一下!
文章“成纤维细胞衍生的LPP作为胃癌治疗反应和治疗靶点的生物标志物”发表在《Mol Ther Oncolytics》,影响因子7.2分。
背景介绍
寻找到导致癌症患者之间免疫检查点抑制剂,如PD-1,PD-L1治疗差异的原因,一直是众多论文的点睛之笔。
肿瘤微环境与基因组异常改变联合分析,可以体现出不同亚组癌症患者之间的异质性。
3、融合基因,是指两个或者多个基因联合起来,一起转录形成一个转录本。这个过程一般由于染色体易位、缺失等原因所致。慢性粒细胞白血病,其分子生物学特征就是检测到BCR-ABL融合基因,该融合基因翻译出的融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性,会导致细胞过度增殖、细胞凋亡受抑制。
3、脂质瘤首选伴侣 (lipoma preferred partner, LPP) 在既往研究中被鉴定为高迁移基团蛋白(高迁移基蛋白, HMGI-C)和混合血统白血病 (mixed lineage leukemia, MLL)的融合基因。LPP与HMGI-C的融合蛋白的表达会使NIH3T3细胞的恶性转化。[1][2][3]
结果展示
GC中PD-L1和IFN-γ相关亚群
GC中PD-L1-和IFN-γ相关亚群
公共数据库入选的胃癌队列有,TCGA-STAD (n = 350)、GSE26899 (n = 93)、GSE26901 (n = 109)、GSE66229 (n = 300)和GSE28541 (n = 40),共计892个胃癌样本。作者首先估计了肿瘤样本中22种免疫细胞类型的丰度,发现七个类型的免疫细胞(CD8 + T细胞,激活CD4 +记忆T细胞,滤泡辅助T细胞,γδT细胞,激活NK细胞,M1 巨噬细胞,中性粒细胞)与PD1存在正相关,四个类型的免疫细胞(浆细胞,CD4 + 记忆T细胞,调节性T细胞,和M2巨噬细胞)与PD-L1表达水平呈负相关 (图1A)。作者接下来选择对IFN-γ进行同样的相关性分析,(IFN-γ是PD-L1转录诱导因子,由活化的T和NK细胞分泌),结果发现IFN-γ与免疫细胞的相关性分析结果与PD-L1具有一致性(图1B)。
然后,作者通过机器学习算法(LASSO),对5个队列中PD1和IFN-g表达水平相关的免疫细胞进行排序。鉴定出7种最相关的免疫细胞,包括静息CD4 +记忆T细胞、活化CD4 +记忆T细胞、γ δ T细胞、单核细胞、M1巨噬细胞、静息肥大细胞和中性粒细胞。作者选择7种免疫细胞浸润肿瘤的丰度对胃癌患者进行无监督聚类分层。结果显示,胃癌患者被分为三个不同的亚组,分别为亚组A、B和C (图1C)。值得注意的是,在胃癌A组中激活CD4 +记忆T细胞有较高的浸润比例,亚组C则有较高的静息CD4 +记忆T细胞。另外,PD-L1和IFN-γ的表达水平在三个亚组中都显著不同,从A亚组到C亚组逐渐下降(图1D和1E)。生存比较分析显示,A亚组患者预后最差,而C亚组患者预后最好(图1F)。
GC中PD-L1-和IFN-γ相关亚群的基因组特征
GC中PD-L1-和IFN-γ相关亚群的基因组特征
作者对由上一步得到的亚组分型的突变数据进行进一步分析。不同亚组之间的肿瘤突变负荷存在显著差异,A亚组的肿瘤突变负荷水平最高,C亚组的肿瘤突变负荷最低(图2A)。分别取三个亚组中突变频率最高的10个基因取交集,结果发现五个基因(TTN、TP53、MUC16、CSMD3和LRP1B)在三个亚组中具有较高的突变频率(图2B)。作者还绘制了瀑布图示每个亚组中突变频率最高的基因(图2C-E)。在所有三个亚组中,TTN和TP53是最常见的错义突变。其中,亚组A的ARID1A移位突变和PIK3CA错义突变均多于其他两个亚组。B亚组和C亚组中,MUC16错义突变更普遍。值得注意的是,A亚组中有同时突变发生率最高,如PIK3CA和ARID1A突变(图2F),而在B亚组中存在更多的互斥突变事件(如ARID1A和TP53)(图2G)。在C亚组中,大多数突变事件是相对独立的,没有交互作用(图2H)。
另外,PD-L1和IFN-g的表达水平、肿瘤突变和生存结果在A亚组和C亚组显著不同。A亚组17q21.31区(BRCA1)、4p16.1区(WDR1)扩增显著,3p14.2区(FHIT)缺失。C亚组1p31.1区(NEGR1)、3q29区(ATP13A4)扩增,17p11.2区(FAM106A、USP32P2、CCDC144B)缺失。A、C亚组的之间进行差异基因表达分析,分别发现339、375个基因在两组显著上调。富集分析显示,A亚组中上调的基因在抗原加工提呈、免疫细胞分化等免疫活性相关通路中富集,而C亚组中上调的基因则富集包括矿物质吸收和胃酸分泌在内的消化代谢途径。
PD-L1- and IFN-γ-associated risk score for prognostication in GC
PD-L1-和IFN-γ相关风险评分对GC预后的影响
作者从上述A、C亚组差异表达基因中,通过Cox回归分析筛选出45个预后相关基因,其中保护性基因14个,危险性基因31个。然后利用LASSO算法筛选出9个有利基因和5个风险基因作为最佳特征基因(图3A)。
最终的风险评分是根据签名基因的表达及其系数制定的。根据风险评分的最佳临界值将患者分为生存结局明显的低危组和高危组(图3B和3C)。生存比较显示,低危组的生存结果明显优于高危组。作者还使用另一个数据集GSE26899验证了风险评分的分层有效性,并发现了类似的结果(图3D和3E)。
LPP as a hub node in PD-L1- and IFN-γ-associated lncRNA - miRNA-gene regulatory network
LPP作为PD-L1和IFN-γ相关的lncRNA - miRNA基因调控网络的枢纽节点
作者接下来构建了一个PD-L1-和IFN-γ--相关的lncRNA - miRNA基因调控网络,并从这个复杂的机制网络中识别出关键分子。作者发现共有59个miRNA和19个lncRNA在A和C亚组之间存在异常表达(图4A)。图4B显示了来自三个数据库(即miRTarBase、miRDB和TargetScan)的异常表达的miRNA和mRNA之间的预测调控关系(miRNA-gene)。合并StarBase数据库中的lncRNA-miRNA数据,得到最终的lncRNA-miRNA-基因调控网络 (图4C)。基于网络拓扑结构,作者确定LPP基因为该网络的枢纽节点。核心的子网如图4D所示。值得注意的是,作者发现LPP的表达从A亚组到C亚组开始逐渐下降(图4E),这与PD-L1和IFN-g的表达类似。高危组LPP表达高于低危组(图4F)。提示LPP可能在胃癌的发生发展过程中起重要作用。
High expression of LPP is an independent risk factor for poor prognosis in GC
LPP高表达是胃癌预后不良的独立危险因素
TCGA泛癌探索LPP的转录水平(图5A)。结果显示LPP在4种肿瘤类型中显著上调,在9种恶性肿瘤中显著下调。LPP在胃癌中显著过表达。独立数据集GSE66229和GSE29272中也发现了一致的结果(图5B和5C)。通过采用Maximally selected rank statistics算法,作者根据LPP表达水平将患者分为两组(图5D)。生存比较发现,LPP高表达组的生存率低于LPP低表达组(图5E)。在另外两个数据集GSE62254和GSE84437中也发现了类似的结果(图5F 5G)。多因素Cox回归分析显示,在上述3个数据集中,LPP高表达是胃癌患者预后不良的独立因素。
Fibroblast-derived LPP associates with tumor progression and resistance to chemotherapy and immunotherapy in GC
成纤维细胞来源的LPP与胃癌的肿瘤进展和化疗和免疫治疗的耐药性有关
作者还使用HPA数据库,采用胃癌免疫组化结果,观察LPP蛋白在胃癌中的表达。LPP蛋白在肿瘤组织间质成纤维细胞中高表达,而在正常胃组织中几乎未见表达。作者还发现高LPP表达与肿瘤实体中纤维母细胞浸润增加相关(图3B)。LPP的表达与6个成纤维细胞标志物呈正相关,这些标志物用于成纤维细胞的鉴定。如前文所述,LPP在CD4 +活化记忆T细胞高浸润的A亚组中表达增高,患者的预后差。在C亚组中表达降低,表现为静息CD4 +记忆T细胞浸润率高,预后较好。在本研究中,作者发现LPP高表达与激活的CD4 +记忆T细胞浸润水平以及较低的静息的CD4 +记忆T细胞浸润水平相关。
为了进一步验证成纤维细胞来源LPP的表达及其在胃癌进展的过程中,作者临床收集15对临床标本,采用免疫组化染色法验证LPP蛋白的表达。结果显示LPP蛋白在肿瘤炎症中高表达。(图6A和6B)。此外,作者由增加单细胞分析来丰富结果,结果显示LPP在成纤维细胞中显著富集 (图6C和6D)。连续组织切片染色显示LPP蛋白在成纤维细胞中受限表达,并且与内皮细胞标志物CD34等分布明显不同(图6E)。为了进一步评估纤维母细胞来源的LPP在GC发展中的作用,我们建立了稳定的LPP敲除成纤维细胞细胞系,用于体内肿瘤生长实验(图6F)。结果显示,注射GC细胞混合LPP敲除成纤维细胞的小鼠,其肿瘤体积比注射癌细胞混合对照的小鼠小(图6G和6H)。这些结果表明,成纤维细胞来源的LPP与胃癌的肿瘤生长有关。
为了研究成纤维细胞来源的LPP表达对化疗反应的影响,作者使用TCGA-STAD数据集评估GDSC数据库中四种临床使用的化疗药物(顺铂、多西他赛、吉西他滨和紫杉醇)的半最大抑制浓度(IC50)值。结果显示LPP高表达患者四种化合物的IC50值均高于LPP低表达患者,提示LPP高表达患者基于化疗对这些化合物的敏感性较低(图7A 7D)。通过使用另一个数据集GSE62254,我们验证了LPP高表达的患者比LPP低表达的患者获益更少,无论是否在化疗的条件下(图7E 7H)。这些结果提示LPP高表达的GC患者对当前化疗方案的反应较低。然后,作者进一步使用GEO胃癌数据集,包括45名接受免疫治疗的胃癌患者,研究了LPP表达与免疫治疗反应的关联。结果显示LPP在反应患者中的表达低于无反应患者(图8A和8B)。LPP高表达的患者比LPP低表达的患者反应更低(图8C)。作者还对另一个包含26名接受抗PD-1治疗的黑色素瘤患者的队列进行了验证,也获得了类似的结果 (图8D -F)。
此外,作者计算了肿瘤免疫功能障碍和排斥(TIDE)评分,以预测TCGA-STAD队列中胃癌患者对免疫检查点封锁的反应。结果显示,LPP高表达患者的TIDE评分高于LPP低表达患者(图8G)。根据患者的TIDE评分,将患者分为有响应者和无响应者两组(图8H)。我们发现高表达LPP组的有效率低于低表达LPP组(图8I)。这些结果表明,LPP的高表达可增加胃癌患者的免疫逃逸和免疫治疗抵抗的能力。
Underlying chemical compounds sensitive to GC patients with high LPP expression
LPP高表达的GC患者敏感的基础化合物
通过GDSC数据库,作者进一步探索了对LPP高表达GC患者敏感的潜在化合物。根据每个TCGA-STAD样品中138个化合物的IC50值,共有28个化合物被鉴定为GC患者高LPP表达的敏感药物。这些化合物靶向于参与肿瘤发生的典型通路,如IGF1R、JNK和p38、PI3K/MTOR、细胞周期和凋亡调控信号通路。作者的发现有助于胃癌治疗的药物,并建立与化疗和免疫治疗联合对抗耐药性的靶。
总结
本篇范文,作者在5个胃癌公共数据集中找出与PD-1以及IFN-γ分子最相关的免疫细胞,根据这些免疫细胞的丰度,对TCGA胃癌患者进行聚类分型,再走后面的差异基因,预后模型套路。数据集是固定的,作者只讨论了胃癌,其它癌种,更换一下也可复现哦!
1. Petit MM, Fradelizi J, Golsteyn RM, et al. LPP, an actin cytoskeleton protein related to zyxin, harbors a nuclear export signal and transcriptional activation capacity. Molecular biology of the cell. 2000;111:117-129.
2. Dahéron L, Veinstein A, Brizard F, et al. Human LPP gene is fused to MLL in a secondary acute leukemia with a t(3;11) (q28;q23). Genes, chromosomes & cancer. 2001;314:382-389.
3. Fedele M, Berlingieri MT, Scala S, et al. Truncated and chimeric HMGI-C genes induce neoplastic transformation of NIH3T3 murine fibroblasts. Oncogene. 1998;174:413-418.