今天给大家分享一篇2022年9月26日发表在Nature Communications(IF: 17.694)上,基于RAS致癌通路预测肺腺癌对化疗的治疗反应以及预后的文章。
RAS oncogenic activity predicts response to chemotherapy and outcome in lung
adenocarcinoma
RAS致癌通路预测肺腺癌对化疗的治疗反应以及预后
一.研究背景
RAS癌基因在将近20%的人类癌症中发生突变,是肿瘤发生和发展的驱动因素。点突变主要发生在三种亚型HRAS、KRAS和NRAS的密码子12、13和61中,并且点突变的发生会降低其编码蛋白的GTPase活性,导致GTP结合的活性构象的积累。其中,KRAS是最常突变的RAS亚型,在胰腺导管腺癌(88%)、大肠腺癌(50%)和肺腺癌(32%)中的发病率特别高。大量文献报道KRAS的突变在肿瘤侵袭性、转移和化疗抵抗中起到重要作用。
在此,本研究提出了一种基于RAS调节转录活性的样本分子分型方法,该方法可预测肺腺癌和其他实体肿瘤的化疗治疗疗效以及预后反应。作者推导出一个基因表达相关的特征称为RAS84,并应用机器学习算法构建分类器,根据患者肿瘤中RAS84的表达对患者进行亚型分类。使用这种方法,作者发现RAS转录活性可以预测肺腺癌和其他几种实体肿瘤的临床预后,但实际上,KRAS突变本身并不能很好地预测这些癌症的临床预后。当将RAS84应用于化疗治疗患者队列时,该研究的分类器预测RAS84表达水平最高的受试者治疗疗效较差。该方法将为研究大队列患者中致癌RAS活性的影响提供可能性,并有助于预测与致癌RAS活性相关的治疗敏感性,例如化疗等。
二.研究结果
1、利用肺癌细胞系基因表达数据构建RAS84
作者旨在测量肿瘤细胞中RAS通路的活性。因此,作者将已建立的特征映射到CCLE数据库中的肺癌细胞系数据,以确定哪些特征能够准确测量并排除样本中的基质细胞和免疫细胞致癌RAS活性。首先,作者通过去除细胞系中低表达或表达差异较小的基因来清除特征。为了进行准确分析,作者去除了KRAS以外(BRAF、EGFR、ERBB2、FGFR1、FGFR2、FGFR 3、HRAS、JAK2、KIT、NRAS和RET)具有致癌RAS通路突变的细胞系,因为这些突变可能也会驱动RAS信号传导并混淆分析。对于每个特征,将过滤后的CCLE肺癌细胞系特征表达矩阵分为三组。作者根据组内特征基因的平均表达将簇命名为RAS-high和RAS-low以及Unclassified。随后,作者使用KRAS突变在RAS-high和RAS-low组中的分布来评估RAS84捕获RAS致癌活性的能力(图1a)。为了强调检测RAS致癌活性特征的特异性,作者还评估了RAS addiction signature和其他几种致癌信号通路特征。RAS addiction signature来自依赖RAS信号维持细胞存活的KRAS突变细胞系。因此,这一特征更能代表RAS依赖性,而不是RAS致癌活性。作者确定“RAS pathway”、“KRASG13D134”和“HRAS”是RAS-high组中KRAS突变体富集的最佳体现(图1a)。随后,作者通过选择驱动RAS-high和RAS-low聚类的基因来完善这三个特征。作者对这些组进行了差异基因分析,以确定RAS-high组中上调的特征基因。从这些基因中,作者构建了meta-RAS活性特征RAS84,并将其与CCLE肺癌细胞系数据进行了对比测试(图1b)。RAS84成功地将42株KRAS突变株系中的36株放入RAS-high组,6株放入Unclassified组(图1c)。作者还观察到“RAS pathway”和RAS84分类之间的样本标记有很好的重叠,并且与其他特征相比有一些差异。然而,与其他RAS和致癌特征相比,RAS84从RAS-low组中分离出的KRAS突变细胞系在统计学上最显著可靠(图1d)。最后,作者进行了差异分析,以确定RAS-high组的转录组变化,并发现RAS-high组在ERK1/ERK2/MAPK级联通路中富集。
2. RAS84表达预测体外药物敏感性和耐药性
接下来,为了确定RAS84表达是否与抗癌药物反应相关,作者分析了从GDSC和CTRP数据库下载的药物敏感性数据,研究对象为RAS-high和RAS-low CCLE细胞系。作者确定了在这两组中这些药物具有不同的药物反应(图2a)。
作者在表现出不同反应的药物中测试了富集的药物靶项(图2b)。并发现RAS-high细胞系对靶向ERK MAPK和EGFR信号的药物敏感,也对蛋白质稳定性和降解药物敏感,如HSP90抑制剂。相反,作者发现RAS-high细胞系对靶向DNA复制、有丝分裂和染色质组蛋白乙酰化的药物具有耐药性。DNA复制和有丝分裂是常见的化疗靶点,表明RAS84活性与体外化疗耐药相关。
随后,作者还测试了KRAS突变(图2c)和RAS通路突变依赖性药物反应(图2d)。并发现这两个突变组仅对三种靶向ERK/MAPK信号的药物敏感。在这些比较中,没有观察到对任何药物的耐药性。这一结果表明,RAS84比单独存在KRAS突变或更广泛的RAS通路突变体更好地捕捉RAS驱动的药物反应,突显了RAS84转录特征方法的重要性。
3. 肺腺癌中RAS84表达与KRAS突变相关
为了进一步验证RAS84不仅仅局限于细胞系层面,作者将其应用于TCGA LUAD表达数据。考虑到与细胞系数据相比,患者肿瘤样本中观察到的特征表达的异质性增加,因此将样本分为五组(图3a),发现RAS84表达最低组中具有很少的KRAS突变(6%). 其他分组中均具有较高水平的KRAS突变,介于25%和45%之间(图3b)。随后,作者使用上述各种特征对患者进行重新分组,发现RAS84在各组中对KRAS突变肿瘤进行了最佳分离(图3c)。作者通过RAS84基因特征的平均表达水平,从低到高分别标记为RAG-0、RAG-1、RAG-2、RAG-3和RAG-4。为了确保RAS84表达主要是由肿瘤驱动的,作者观察了五个NSCLC样本的基质中RAS84的表达,并发现基质中表达量最小。随后,给每个患者分配了一个RAS84-Index(RI)值,定义为RAS84的平均表达基因。为了进一步描述这些群体的特征,测试了是否有任何其他报道的基因组改变在五个亚型中表现出非随机分布。作者确定了富集于一个或多个RAG组中的八个常见突变(图3d),并使用这些亚型相关突变来表征五个RAG组的特征(图3a)。KRAS极少突变是RAG-0的特征,但有趣的是,该组包含大量肿瘤抑制突变体(KEAP1、RB1和TP53)以及CTNNB1突变体,这也可以解释肿瘤是如何发生的。由于p53的高水平改变(约70%),将其称为P肿瘤。RAG-2和RAG-3中,除了频繁的KRAS突变外,也具有许多EGFR突变,表明驱动这些簇的基因通过上游受体酪氨酸激酶(RTK)激活诱导RAS通路激活。然而,除了高KRAS突变率和高RAS84表达外,RAG-1以STK11/LKB1突变为主要特征(KL肿瘤),RAG-4的特征是CDKN2A突变(KC肿瘤)。TP53在几个簇中经常改变,RAG-3在RAG-0之后p53突变率最高(KP肿瘤)。而RAG-2与其他RAS活性簇相比,p53(TP53)改变水平适中(约40%),CTNNB1突变更多,但仍仅约5%,称之为K肿瘤。
随后在87名患者的独立肺腺癌队列(GSE40419)中验证了RAG中KRAS、EGFR和TP53突变的模式(图3e)。但考虑到该队列较小,不可能以稳健的方式将所有特征的患者进行聚类,并没有观察到特定的KRAS氨基酸突变与RAG组之间的显著关联,这可能暗示在肺腺癌的情况下,特定的突变不会以不同的方式驱动RAS活性异质性(图3b)。
为了确定RAS84表达是否反映RAS-MAPK信号活性,作者观察了每个RAG内ERK1/2(T202,Y204)和MEK1(S217,S221)的磷酸化水平。对349名TCGA-LUAD患者的TCPA RPPA数据分析发现在所有的RAG中,相较于RAG-0其他RAG ERK1/2和MEK1的磷酸化水平都有所增加(图3f)。作者还研究了哪些RAS84基因主要驱动RAG活性。作者重点研究了各个簇间变异最大的基因,并通过相关性分析,发现了七个能够区分五个RAG的小基因簇(图3g)。
4. RAS84表达主要是克隆性的
为了评估肺腺癌中RAS活性的肿瘤内异质性,作者将来自多区域TRACERx队列的样本(41例患者)分为五个RAS活性组,使用TCGA-LUAD分类结果训练支持向量机(SVM)分类器,并把TRACERx样本按照RAG标签归类(图4a)。
在41例患者中,28例(68%)有多区域RNA序列基因表达数据可用。在这28名患者中,16名(57%)患者的所有区域均位于同一RAG内(图4a)。12名(43%)患者的区域跨越RAG,表明某些患者存在一定程度的RAS活性异质性。在这12名患者中,有9名患者的肿瘤区域的RAG是相邻的(RAG-4/3:4;RAG-3/2:1;RAG-2/1:1;RAG-1/0:3)。其余三名患者(CRUK0017、CRUK0024和CRUK0060)跨越两个以上相邻的RAG,表明整个肿瘤的RAS活性存在一定程度的相关性和异质性。CRUK0017跨越三个簇,RAG-3/2/0。据TRACERx报告,该患者为KRAS突变的亚克隆(PhyloCCF R1:0;R2:0.84;R4:0.65)。有趣的是,KRAS非突变区域属于RAG-0。患者CRUK0024和CRUK0060都有两个非相邻的簇,即RAG-3/1。此外,作者还观察到,与肿瘤间距离分布相比,这些跨越肿瘤的组内RAS84的肿瘤内距离仍然很小(图4b)。
随后,作者在TRACERx肺腺癌队列中发现,RAS84基因在肿瘤内表达差异小和肿瘤间表达差异大组中富集(图4c)。说明RAS84在遇到样本偏差时仍具有较强的鲁棒性。
5. RAS84预测肺腺癌患者的生存率和化疗反应
突变的KRAS癌基因在许多临床前模型中促进肿瘤进展和转移,但KRAS的突变状态与患者生存率并没有显著的相关性(图5a)。为了确定RAS84在肺腺癌中是否具有预后价值,作者进行了单因素Cox比例风险分析,发现与RAG-0相比,RAG-4与不良预后相关(图5b,c)。随后,作者还将RAS84 RAS-Index(RI)值进行单因素Cox比例风险分析,并发现与预后显著正相关,表明RAS84表达增加是总体生存率差的预测因子(图5d)。随后,作者还对RAG进行多因素Cox比例风险分析,模型中除了RI值包括TNM分期、性别和年龄等,并且发现RAG是预后的重要预测因子,特别是RAG-4、RAG-3和RI与不良预后显著相关(图5e-h)。
此外,与已经发表的特征比较发现在校正其他预后预测因子的多变量分析中,只有RAS84显著预测预后(图5i)。这表明RAS84在早期肺腺癌中具有超出已知临床预测因子的预后质量,并进一步表明RAS通路活性促进了人肺腺癌的肿瘤进展。
鉴于在体外观察到化疗耐药表型,作者使用TEMPUS腺癌患者队列进行了PFS多因素Cox比例风险分析。作者选择接受一线化疗的患者,并使用相关的RNA-seq数据和SVM分类器对患者肿瘤进行分类。发现RAG是化疗后PFS的显著预测因子。简而言之,与RAG-2相比,RAG-3和RAG-4患者的PFS较差(图5j)。最后,与其他已发表的RAS特征对进行对比也发现RAG-3以及RAG-4具有比较高的风险(图5k)。
6. RAS84预测不同癌症类型的RAS-MAPK通路活性
RAS活性在肿瘤发生和癌症进展中的重要程度因不同组织而异,已知一些癌症主要由RAS突变驱动(例如胰腺癌、结直肠癌和肺癌),而其他癌症则不是(例如葡萄膜黑色素瘤、胶质母细胞瘤、肾癌)。为了确定RAS84如何确定RAS活性在不同癌症类型中的差异,作者在泛癌分析中对所有32种TCGA实体肿瘤进行了量化。为了比较不同癌症的样本,计算了每个样本的RI值(图6a)。根据每个癌症的平均RI值分布确定了两个不同的癌症人群(图6b)。在RAS高度活跃组中,发现已知RAS驱动的前五种RAS突变癌症中的四种(胰腺癌(PAAD)71%,结肠腺癌(COAD)50%,直肠腺癌(READ)49%和肺腺癌(LUAD)31%)。作者还发现KRAS突变主要富集在该组中。在高RI组中发现的其他癌症包括胃腺癌(STAD)(8.9%)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)(8.3%)、头颈部鳞癌(HNSC)(5.8%)、宫颈鳞癌和宫颈腺癌(5.2%)、肺鳞癌(3.5%)和食管癌(1.2%)。为了解释高RAS活性组中存在这些癌症,作者研究了RAS通路改变状态与队列中平均RI之间的相关性(图6c)。胃癌(STAD)、膀胱癌(BLCA)、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、食管癌(ESCA)和肺鳞状细胞瘤(LUSC)的RAS通路改变率均高于50%,均在99%的置信区间内,表明RAS以外的RAS途径改变是这些癌症的驱动因素。
皮肤黑色素瘤(SKCM)和甲状腺癌(THCA)的平均RIs低于其RAS通路改变率的预测值(图6c)。有趣的是,NRAS是这两种癌症中RAS的主要突变亚型。然而,RAS突变与SKCM中的RI不相关,却在THCA中显示出显著的负相关(图6d),表明突变的RAS不是这些癌症中RAS通路活性的主要驱动因素。有趣的是,THCA和SKCM的BRAF突变比例最高(57%和50%),其次是结肠(10%)。并且发现BRAF突变与高RI值显著相关(图6e)表明BRAF是这两种癌症中致癌RAS通路活性的关键驱动因素。
为了进一步验证RAS84表达可以预测单个癌症中RAS突变体的高RAS活性,观察了每个队列RI值与RAS突变(KRAS、NRAS、HRAS)的关系,并发现PAAD、LUAD、HNSC、THYM、BRCA、UCS等中RAS突变与RI之间存在显著正相关(图6d),进一步强化了RAS84可以预测这些癌症中RAS活性的观点。对于THCA和TGCT这两种癌症,观察到RAS突变与RI呈负相关。如前所述,THCA具有较高的BRAF突变水平,有一些NRAS突变,但很少有KRAS突变。TGCT的特点是KRAS(8%)和NRAS(3%)突变水平低。RAS野生型组中较高的RI活性表明,这些样本中可能存在RAS信号的强烈激活物,例如自分泌生长因子的产生,或突变数据中不明显的突变体中的负反馈环。
为了确定RAS84在除LUAD以外的其他癌症中是否具有预后作用,作者对RAS高度活跃癌症组中的队列进行了总体生存率与RI值的Cox比例风险回归分析,并且确定了PAAD与CESC中RAS84表达与预后的显著相关性(图6f,g)。
三、总结
这篇文章开发了一种新的基因特征RAS84,可以很好地用于捕获肺腺癌中的RAS通路致癌活性。使用RAS84特征不仅可以很好地将肺腺癌患者进行分层还可以预测患者的预后以及化疗反应。相较于其他特征构建文章,该研究首先以体外细胞系特征构建为切入点,后结合不同中心的肺腺癌研究队列进行特征验证,区分肿瘤亚型,进行细致的解析刻画,是有助于临床决策的。因此,小编认为这种分析方式和角度是很值得尝试的!!!