在过去的十年中,随着各种免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞治疗的开发和应用,免疫疗法领域已经彻底改变了许多癌症的治疗。其中,由于T细胞在癌症治疗中占据着重要的地位,能够触发针对新抗原的新T细胞反应的个性化疫苗,将成为另一种有希望的癌症免疫治疗方法。因此,今天小编带大家阅读一篇2022年4月3日发表在nature cancer上的一篇文章,看看作者是如何探究T细胞在联合治疗中的作用。
Concurrent delivery of immune checkpoint blockade modulates T cell dynamics to enhance neoantigen vaccine-generated antitumor immunity
免疫检查点阻断剂的协同传递可调节T细胞动态以增强新抗原疫苗产生的抗肿瘤免疫力
文章摘要
新抗原疫苗旨在诱导肿瘤特异T细胞反应,并且在早期临床试验中取得了良好的抗肿瘤效果。然而,关于这种治疗的反应或抵抗的基本机制尚不清楚。作者观察到新抗原疫苗产生的T细胞可以与免疫检查点阻断协同作用,从而有效控制肿瘤。具体来说,作者对超过10万个T细胞进行了单细胞测序,发现联合治疗能诱导抗原特异性CD8 T细胞群,具有活跃的趋化因子信号,较低的共抑制受体表达和较高的细胞毒性。此外,联合治疗需要在引流淋巴结中产生新抗原特异性T细胞。这一独特群体的特征基因与T细胞的克隆频率和人类更好的生存有关。该研究描述了新抗原疫苗和免疫检查点阻断治疗期间肿瘤浸润T细胞的动态,并识别新抗原反应性T细胞特征,以利于未来治疗策略的制定。
结果
新抗原疫苗与ICB协同作用,诱发持久的抗肿瘤免疫反应
为了研究新抗原疫苗诱导的体内T细胞反应和抗肿瘤作用,首先对小鼠结肠直肠肿瘤模型MC38进行了新抗原疫苗治疗。根据最近新抗原疫苗研究的剂量和时间表,选择了9聚体突变的ADP依赖性葡糖激酶肽 (ASMTNMELM) 作为新抗原以及两种Toll样受体(TLR) 受体激动剂作为佐剂。两剂新抗原ADPGK疫苗显示出适度的抗肿瘤作用,肿瘤生长延迟(图1a)。然而没有观察到肿瘤消退,表明单独使用新抗原疫苗的抗肿瘤作用有限。接下来检查了引流淋巴结(DLN) 中新抗原特异性T细胞的水平。无论小鼠是否患有肿瘤,与非DLNs相比,疫苗接种有效地诱导了DLNs中的tetramer+细胞(图1b)。然而,与淋巴结中的T细胞相比,肿瘤组织中的新抗原ADPGK特异性T细胞在接种疫苗后略有增加,并表现出耗竭型,PD-1和TIM-3表达升高(图1c)。肿瘤组织中的ADPGK特异性T细胞与DLNs相比TOX表达水平更高(图 1d)。基于这些结果,作者假设免疫抑制性TME通过控制T细胞功能状态来限制新抗原疫苗接种的功效。为了检验这一假设,首先分析了来自MC38模型TIL的PD-L1表达的scRNA-seq数据。肿瘤中的髓样细胞群,尤其是中性粒细胞和常规树突状细胞的PD-L1表达水平高于淋巴结中的相应细胞群(图 1e)。单独用抗PD-L1或新抗原疫苗治疗携带MC38的小鼠显示部分反应,而联合治疗导致肿瘤完全消退并显着提高存活率(图 1f-h),这证实了PD-1/PD-L1信号对新抗原疫苗接种的抑制作用。该小鼠模型和作者的治疗方案重现了人体临床试验中的观察结果,适合研究联合治疗的机制。对从未治疗小鼠(第10天和20天)的肿瘤、DLN和脾组织中收集的T细胞(作为对照)和从不同疗法下的小鼠(第20天)中收集的T细胞进行了具有靶向TCR捕获的scRNA-seq(scTCR-seq ),以研究T细胞群体的动态变化。同时,新抗原ADPGK特异性T细胞也通过四聚体分选进行富集,以进行scTCR-seq,其用于下游分析,以鉴定新抗原反应性T细胞簇(图1i)。
T细胞群的高分辨率表征
在这章中作者对细胞分亚群。本研究中获得了100,899个T细胞的scRNA-seq谱,其中包含95,138对TCR序列。质量控制后,保留93,399个T细胞用于下游分析。根据差异表达基因和组织分布模式区分23个簇,推断它们的潜在功能(图2a)。在不同治疗组的淋巴和肿瘤组织之间,这些簇的分布存在高度异质性。特别是,CD8-01-Sell-P.na和CD4-01-Tcf7-P.na等在淋巴组织中富集,肿瘤浸润性T细胞中主要富集CD4和CD8簇(图2b-d)。作者发现DLNs中T细胞的组成相对稳定。而肿瘤T细胞簇在不同疗法中表现出更高的异质性。接下来定义了肿瘤中CD4和CD8 T细胞的动态变化。CD4 T细胞表达共刺激分子(图2b、c)。除了典型的CD8+ T细胞簇,作者还鉴定了两个与TME中其他明确定义的CD8 T细胞群不共享相同signature基因的独特CD8簇。一种是CD8-09 簇,类似于上皮内淋巴细胞 (IEL)。另一种(CD8-07)仅见ICB治疗组(图2d),具有与CD8-08相似的耗竭表型,但表达更高水平的颗粒酶家族基因,将此簇定义为ICB治疗响应者。在此章节中发现,ICB和新抗原疫苗的组合通过诱导不同的T细胞簇来重塑TME。
联合治疗使TME恢复活力,有利于Teff细胞功能
为了研究肿瘤进展过程中T细胞状态的动态,比较了早期和晚期的T细胞组分,发现TME在早期由新浸润的T细胞组成,在晚期具有更强的免疫抑制性。新抗原疫苗单一疗法降低了功能障碍CD8 T细胞的百分比,同时增加CD8 Teff细胞。然而,治疗期间Treg细胞的比例也增加,这可能解释了为什么新抗原疫苗治疗仅诱导了有限的抗肿瘤效果。与单独使用疫苗相比,联合使用ICB疫苗可显著增加Teff细胞,并减少功能失调的CD8 T细胞和Treg细胞。为了证实scRNA-seq定义的这些观察结果,应用流式细胞术在蛋白质水平对代表性标记进行染色。早期肿瘤含有许多幼稚表型的T细胞(图2e,h)。作者还证实,用联合疗法治疗的肿瘤具有较低水平的Treg细胞(图2i)和衰竭表型的CD8 T细胞(图2f)。联合治疗也显着降低了TOX+ CD8 T细胞的百分比(图2g)。同时,联合治疗组中CD4-TH1细胞增加(图 2j)。基于这些结果,作者得出结论,联合治疗产生了可能有利于Teff细胞功能的TME。
克隆T细胞状态转换的谱系跟踪
本研究获得了12,053个克隆T细胞(图3a),大多数克隆T细胞分布在富含肿瘤的簇中,对不同治疗的反应有显著变化(图 3b,c)。然后使用克隆评分(CS)来量化克隆扩增的程度。在所有CD8+ T细胞簇中,CD8-08是 20天组中的主要克隆扩增簇(图 3d)。 在 CD4+ T细胞中,Treg细胞和TH1样T细胞(CD4-06)在大多数肿瘤样本中表现出最高的克隆扩增(图 3e)。然而,在联合处理后,Treg细胞的克隆扩增能力被显著抑制。此外,联合治疗也促进了CD4-06的克隆扩增。这些结果表明,联合治疗可以通过调节 T 细胞的扩增能力来重塑 TME。接下来,研究了T细胞簇的克隆共享,以跟踪其潜在的迁移和状态过渡,克隆共享发生在不同的肿瘤内CD8+簇之间(图3F),表明TME中的CD8+ T细胞通常经历广泛的状态过渡。研究T细胞簇的克隆共享,以跟踪其潜在的迁移和状态转换,作者发现克隆共享发生在不同的肿瘤内CD8+簇之间(图3f),表明TME淋巴瘤中的CD8+ T细胞通常经历广泛的状态转换。在新抗原疫苗组中,一致性克隆最高(图3g),即疫苗治疗可能促进T细胞从淋巴组织中募集。接下来作者定义了迁移分数,即两个簇之间共享克隆的加权熵,以表征淋巴簇和肿瘤内簇之间的迁移。在所有瘤内CD8+簇中,大多数治疗组中CD8-05向CD8-03的迁移评分最高(图3h),表明随后在TME发生了CD8 Teff细胞表型转化。接下来进行伪时序分析,发现轨迹起源于状态1,结束于状态4(图3i)。沿着轨迹的T细胞表现出衰竭和细胞毒性评分增加,干性评分降低(图3j,k)。
新抗原特异性T细胞富含CD8 Teff细胞簇
使用iSMART算法,根据TCR的相似性对TCR进行聚类鉴定了1,415个 TCR组。然后,将每组中T细胞的数量与其在未处理小鼠淋巴组织中的数量进行比较,发现20个TCR组显着富集。将这些TCR定义为高置信度的新抗原ADPGK特异性TCR(图 4a )。使用这些TCR跟踪scRNA-seq数据中的新抗原特异性T细胞,发现它们在联合治疗组中富集(图 4b)。具体而言,CD8-05 和CD8-04含有比任何其他肿瘤内CD8簇更高多的新抗原特异性 T 细胞(图 4c),这是由多个TCR组驱动的(图 4d)。进一步研究了CD8-05 T细胞的DEGs,以鉴定该T细胞亚群的特征基因。细胞毒性效应分子,在该簇中要高得多。同时,趋化因子及趋化因子受体也上调,说明这些细胞有迁移能力(图4e)。此外,这些细胞还激活CD69的表达,显著降低的共抑制分子(图4f)。富集分析结果进一步证实了上一步的结论(图4g)。
联合治疗在体内诱导新抗原特异性 Teff 细胞
接下来进行了实验以验证体内Teff细胞的表型。首先在不同的免疫疗法后对TIL 进行四聚体染色。与单一疗法相比,联合治疗显着增加了tetramer+ 细胞的频率(图 5a、b )。与单独治疗相比,联合治疗显着降低了LAG3+ CD8 T细胞的百分比,TIL中CXCR3的表达上调(图 5c、d )。这与我们在scRNA-seq中的发现一致,这表明CD8-05中的大多数T细胞是Lag3- 并且一些细胞Cxcr3的表达上调(图 4f)。
来自DLN的新抗原特异性T细胞引发抗肿瘤效应
作者使用FTY720,在联合治疗之前和期间阻止T细胞从淋巴结流出(图 5e)。FTY720完全消除了抗肿瘤作用,表明来自DLN的新浸润T细胞是必不可少的(图5f)。同时,FTY720治疗显着降低了产生IFN-γ的CD8 T细胞(图5g)和tetramer+ T细胞(图5h)的百分比,进一步表明在肿瘤中淋巴组织是新抗原特异性T细胞的主要来源。给naïve小鼠接种新抗原疫苗,并在6天后收集DLN中的淋巴细胞。然后将细胞过继转移到携带MC38的 Rag1-/- 小鼠,然后进行抗PD-L1治疗(图5i)。 DLN中的新抗原疫苗刺激的淋巴细胞与抗PD-L1协同控制肿瘤(图 5j)。此外,在疫苗引发的淋巴细胞过继转移后,抗PD-L1治疗显着增加了脾脏和肿瘤中抗原特异性T细胞的百分比(图5k,1)。在联合治疗后,特异于另一个MC38表位的T细胞百分比也显著增加,表明T细胞反应可能在最初的肿瘤抗原启动后发生表位扩散(图 5m-o)。基于这些结果发现,抗PD-L1通过再生来自DLN的新抗原特异性T细胞扩大了新抗原疫苗的治疗效果。
新抗原特异性 T 细胞基因特征与人类癌症的更好临床结果相关
为了探索MC38的新抗原特异性T细胞基因特征在人类癌症中是否具有可重复性,首先定义了新抗原特异性T细胞的基因特征。选择了在人类基因组中也有的CD8-05的DEGs,并通过使用每个DEG作为CD8-05与所有其他CD8 T细胞的预测指标,进行监督特征选择。前5个marker的平均表达量达到了0.92的AUC。因此,将这五个marker的平均表达量定义为癌症抗原特异性T细胞(CAST)得分,它可以作为新抗原特异性T细胞部分的替代物(图6a)。接下来估计了TCGA数据库中人类癌症的CAST评分,并选择了23种癌症类型和100多名患者来研究其在预后中的作用。由于CD8 T细胞浸润是多种TCGA癌症患者预后的预测因素,针对CD8 T细胞水平分层进行Cox比例风险回归分析,并估计了单因素Cox模型中CAST评分的风险比(HR)(图6b)。在黑色素瘤、头颈部、宫颈癌和胰腺癌中,CAST评分评分高,CD8 T细胞浸润高的患者的总生存率更好(图6c-j)。因此,小鼠新抗原特异性T细胞的鉴别性标记可以预测CD8 T细胞高浸润的患者生存率。由于大多数TCGA样本没有经过免疫治疗,作者分析了抗PD-1治疗前后的晚期基底细胞癌(BCC)患者的公共数据集。事实上,CAST评分与CD8+T细胞克隆频率有极大的相关性(图6k)。此外,具有高CAST分数的大克隆在表型上是相似的(图6l)。最后,抗PD-1治疗增加了四个病人中三个的CAST分数(图6m),从而证实了ICB在TME中扩大抗原特异性T细胞的作用。
总结
作者从新抗原疫苗与ICB的协同作用出发,分析T细胞的scRNA-seq,解析内在机制。这个工作补充了当前对新抗原疫苗的人体临床研究,并解决了有关其抗肿瘤免疫反应的一些基本问题。近些年来单细胞领域快速发展,是大家研究的热点,生信人平台也持续关注着这个领域,感兴趣的小伙伴赶紧上车吧!
参考文献:
Advances in the development of personalized neoantigen-based therapeutic cancer vaccines