今天小编给大家介绍一篇这个月刚发在Nature communication[IF:14.913]上的文章——利用单细胞数据研究儿童神经母细胞瘤的高低风险组的细胞差异。作者的研究表明，低风险和高风险神经母细胞瘤有不同的细胞身份，代表两种疾病实体。让我们一起来看一下整体的研究思路吧！
Single-nuclei transcriptomes from human adrenal gland reveal distinct cellular identities of low and high-risk neuroblastoma tumors
一、研究背景：
神经母细胞瘤是一种起源于肾上腺交感细胞系的儿童癌症。这种恶性肿瘤占儿童癌症病例的8 - 10%，占全世界儿童肿瘤死亡病例的15%。神经母细胞瘤的临床结局是异质性的，它可能会朝向死亡进展，但也有可能会自我消散。
年龄是神经母细胞瘤最主要的风险因素，诊断时小于18个月的小孩往往具有更好的预后。然而，为什么诊断时患者的年龄是风险和预后最有力的预测因素？这一原因目前还不清楚。此前，有报道称，小鼠中形成肾上腺髓质的嗜铬细胞大多数来自胚胎神经嵴后代，特别是来自多能Schwann细胞前体。
二、数据和代码
数据：
- 不同风险组的11个不同年龄的神经母细胞瘤样本（0-79个月）的数据
- 3个人类的健康肾上腺的数据
- 5个健康小鼠肾上腺的数据
代码：https://github.com/oscarcbr/nc_nb_2021
三、研究结果
一)、出生后的人类和小鼠肾上腺细胞群相同，但在嗜铬细胞上表现出差异
- 对来自三个不同患者的1536个人类肾上腺细胞、来自5个不同小鼠样本的1920个肾上腺细胞进行了单核Smart-seq2测序，选择高质量的细胞【人类：n = 1322；小鼠：n = 1763】。
- 用PAGODA 进一步加工。通过来自文献的多个特定marker鉴定人类和小鼠肾上腺细胞cluster的身份。在人类中，hC4被鉴定为嗜铬细胞簇。在小鼠中，mC11和mC15被鉴定为嗜铬细胞(Fig.1a；1b)。
- 通过比较人类和小鼠的特异性基因标记，发现间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞簇的转录标记相似，但两种不同的嗜铬细胞只能在小鼠中分化。其中，小鼠嗜铬细胞群mC15与人类嗜铬细胞群hC4共享一个更重要的特定基因marker(Fig.1c；1d)。
- 与小鼠的嗜铬细胞相比，人类出生后嗜铬细胞(hC4)表现出交感细胞标记物PRPH的显著表达(Fig.2a)。
Fig.1 单核/细胞分析揭示了人类和小鼠肾上腺(AG)的解剖学
二)、人出生后肾上腺胆碱能祖细胞群的鉴定
- 作者发现了一种人类出生后肾上腺特有的细胞群(hC1)，显著表达各种祖细胞和迁移marker。并且呈现增殖性质。利用伪时间进行的RNA速率估计表明，这类细胞群体(hC1)是嗜铬细胞(hC4)的主要来源(Fig.1e-h)。
- 为了验证人胆碱能祖细胞(hC1)的表达和空间背景，作者对0- 4岁儿童和成人的出生后肾上腺进行了一系列RNAscope原位杂交(Fig.2b-e)。
- 作者首先阐明了髓质(TH)、皮质(CYP11B2)和包膜(RSPO3)各部分腺体的解剖结构。为了识别属于hC1祖细胞群的细胞，检测了在hC1祖细胞群中显著上调的标记:NTRK2和CLDN11(Fig.2b-d)。
- 将胆碱能烟碱受体CHRNA7(即nAChR α7)与TH和CLDN11进行了原位rna杂交。证实CLDN11+细胞具有胆碱能性质(Fig.2e)
Fig.2人胆碱能前体(NTRK2+ CLDN11+)和嗜铬细胞(TH+)在出生后人肾上腺(AG)中的定位
三)、不同风险组的神经母细胞瘤在细胞群组成上存在差异
- 对11个不同临床风险组和遗传亚群的4224个人类NB细胞进行单核测序，用PAGODA将高质量的细胞(n = 3212)分成10个不同的簇(Fig.3a)。
- 不同临床风险组和阶段的神经母细胞瘤样本包含这些簇的不同细胞贡献，反映了这些临床组的临床异质性(Fig.3b)。
- 根据每一个cluster显著上调的基因对10个亚群进行重新聚类，分析各个亚群的显著差异的基因(Fig.3c；3d)。
- 利用基于基因富集的方法，NB的去甲肾上腺素能簇(nC5, nC7, nC8和nC9)被证实与交感去甲肾上腺素能和ADR(即肾上腺素能)转录特征共享大量上调基因。与此相反，未分化的聚类nC3共享了大量具有神经嵴细胞样特征和MES(即间充质)特征的上调基因(Fig.3e)。
- 此外，每个神经母细胞瘤簇的特定基因标记与最近报道的8个GOSH 队列肿瘤中6个细胞簇的标记进行了比较(Fig.3g)。
- 为了区分恶性和间质细胞簇，进行了基因组重排分析，并进一步实验验证(Fig.3h-3i)。
Fig.3儿童神经母细胞瘤的瘤内异质性
接下来，我们验证了神经母细胞瘤簇中显著富集的标记物的表达(Fig.4)。RNAscope原位杂交在一例MYCN扩增的神经母细胞瘤病例中，经比较基因组杂交(CGH)20独立证实，显示TH、MYCN和ALK表达在肿瘤内具有高度异质性，肿瘤区域MYCN和ALK染色强烈，TH阴性。其他肿瘤区域显示少量TH+阳性、细胞核增大的细胞弥漫性染色，MYCN阳性，ALK阴性，而其他区域不显示TH、MYCN、ALK表达。此外，我们验证了间充质标记物PDGFRA的表达，该标记物在高危神经母细胞瘤簇中显著高表达。
Fig.4 RNA原位杂交验证高危神经母细胞瘤4期的瘤内异质性
四)、高危神经母细胞瘤中富集的细胞群类似于人类出生后的肾上腺祖细胞群
高危神经母细胞瘤通常发生于年龄大于18个月的儿童，通常起源于肾上腺。为了了解在高风险和低风险病例中观察到的神经母细胞瘤群体与正常的出生后和胚胎肾上腺组织之间的关系，我们对它们的转录谱进行了对比分析(Fig5；6；7)。
- 在低危神经母细胞瘤病例中，肾上腺素能标记物的显著表达在健康交感肾上腺细胞和肿瘤NOR人群中很常见（Fig.5a）。
- 与这一观察结果一致的是，神经母细胞瘤NOR簇的特定基因标记与小鼠胚胎和人类的嗜铬细胞和交感细胞簇以及人类和小鼠出生后的嗜铬细胞簇显著共享。
- 与神经母细胞瘤NOR细胞相比，未分化的神经母细胞瘤簇(nC3, nC2)与小鼠胚胎和出生后的交感细胞或嗜色细胞群体没有共同的特定基因特征(Fig.5b-e)。
Fig.5来自神经母细胞瘤的细胞簇与出生后健康的人和小鼠肾上腺具有相同的表达特征
- 为了支持这些发现，神经母细胞瘤NOR簇在小鼠和人类发育中的肾上腺中桥细胞、交感细胞和嗜铬细胞，以及人类出生后嗜铬细胞中表现出较高的marker 得分。tSNE显示了人类出生后(Fig.6a)、胚胎肾上腺(Fig.6b)和小鼠胚胎肾上腺原细胞簇(Fig.6c)的特征基因评分。
- 对498例具有低风险和高风险特征基因表达的SEQC神经母细胞瘤患者进行生存分析，KM曲线显示，神经母细胞瘤有显著的差异（Fig.6h）。
- 在更大的队列中，我们进一步详细分析了不同神经母细胞瘤簇的转录谱与生存率和诊断年龄之间的关系。分别比较了498例患者的风险组的差异表达（Fig.6e）、与诊断年龄显著相关（Fig.6f）、与生存结果差异表达（Fig.6g）
- 条形图展示了与nC9和nC3相关的特征基因与诊断时的年龄显著相关，而与高生存率相关的特征基因则与年龄呈负相关(Fig.6h)。
Fig.6 来自神经母细胞瘤和发展中的人类和小鼠肾上腺的细胞簇具有不同的表达特征，它们的表达与患者的生存和诊断年龄相关
- 作者进一步研究了人类出生后肾上腺和神经母细胞瘤簇的共性，并基于相互最近邻匹配检测进行了对比分析，将来自人类肾上腺的细胞状态投射到神经母细胞瘤数据上（Fig7.ab）。
- 此外，作者还研究了胚胎小鼠肾上腺原、神经母细胞瘤和健康人类出生后肾上腺细胞群之间的关系。对所有群体(不包括皮层和免疫细胞)的转录相似性进行了基于欧氏距离的分析(Fig7.cd)。该分析表明，这些细胞可以分为四组，即(1)肾上腺素能细胞，(2)未分化细胞，(3)间充质细胞和(4)内皮细胞
Fig.7 出生后和发育中的人类和小鼠肾上腺和神经母细胞瘤细胞群转录谱的共性
四、结果与展望
为了解神经母细胞瘤临床异质性的转录基础，作者分析了来自不同风险组的11个肿瘤患者的3212个高质量单细胞/核。并将它们与3456个人类和小鼠胚胎和出生后AG细胞进行比较。在出生后的肾上腺中，嗜铬细胞的再生方式仍是未知的。在这项研究中，作者鉴定了一群出生后人类肾上腺特有的细胞，这些细胞具有嗜铬细胞的前体特征，通过计算RNA速度确定了祖细胞向嗜铬细胞转变的方向性。RNAscope ISH验证了它们的存在，并提示这一群体随着年龄的增长而下降。高风险相关细胞簇(nC3)有一个转录程序，随着诊断年龄的改变而改变，并与患者较低的生存几率相关。
因此，诊断时的年龄是一个强有力的预测结果。这给我们今后的单细胞分析结合临床特征提供了一个很好的思路——肿瘤的临床异质性可能是在单细胞层面具有不同的细胞身份，代表不同的疾病实体。
