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用端粒酶如何发表7分+的文章
Genomic, epigenomic, and transcriptomic signatures for telomerase complex components: a pan-cancer analysis
这个是今年1月份发表在Molecular Oncology（IF：7.4）杂志上的整合转录组、基因组数据，研究端粒酶的文章，文章思路严谨，具有很好的参考意义。
端粒的概念诞生于二十世纪三十年代，即染色体的末端能稳定染色体结构和功能的特殊成分，而研究发现随着细胞复制，端粒会逐渐缩短。然而，端粒酶的作用就是延长端粒，但端粒酶的活性可在多达90%的人类恶性肿瘤中检测到。
背景
在大多数正常的人类细胞中，端粒酶是沉默的，因此端粒随着体外细胞复制的逐渐缩短。当端粒长度失能时，DNA损伤反应被激活，从而诱导正常细胞的永久生长停滞或凋亡。端粒酶是一种能够修复端粒的多单元复合物，而其核心酶仅由催化组分端粒酶逆转录酶(TERT)和内部含模板的端粒酶RNA (TERC)组成，但是它的激活也往往意味着细胞恶性的开始。
该研究也分为以下几个阶段：下载TCGA数据，端粒酶组成成分（10种基因）在泛癌中的表达情况；根据基因表达情况进行亚组分类；不同亚组的肿瘤干性指数、侵袭性、EMT评分、基因组稳定性、m6A甲基化情况；随后联合其它数据库评估了免疫治疗情况，并确定靶向端粒酶成分的药物。研究过程中也有用自己的细胞实验对TCAB1。
结果
1.端粒酶的10种组成成分在泛癌中的表达
（1）端粒酶组成成分包括NHP2、DKC1、NOP10、TCAB1和GAR1与端粒酶核心TERT（端粒酶逆转录酶）和TERC（端粒酶 RNA 组分）稳定相关；NVL提供ATP；
（2）分析了10种基因在33种癌症中的相关性。
2.端粒酶的聚类分析
（1）作者使用【无监督分类聚集分析法】根据10种基因在33种癌症中的表达情况将分为TS-CA（高表达）、TS-CB（低表达）和TS-CC（介于两者回见），构建端粒酶（TS）评分。
（2）随后对又分析了10 种基因在三种分类中的表达情况。
（3）三种不同亚型与预后的关系：TS-CA更好的预后，且B与C之间没有差异（图1F）；进一步泛癌分析发现10种癌症有更明显的不良预后（图1G）；最后，分析了10种基因表达与各种癌症预后的关系（图1G）。
图1基于端粒酶成分表达的泛癌分层及其与患者生存的关系
3.肿瘤干性指数分析、侵袭性、EMT评分分析
目的：确定高TS组患者生存不良的表型基础
（1）肿瘤干性指数
作者使用EXTEND算法计算了三个亚型的肿瘤干性指数（图2A）；随后又分析了所有患者该指数之间的相关性（图2B）；最后又绘制了；33种癌症的TS评分与肿瘤干性指数的关系（图3C）
（2）肿瘤侵袭性评估
Ki67为特异性标记，分析其与TS评分的关系；对所有患者进行分析，Ki67 mRNA丰度与TS评分显著相关（图2D）；在每种癌症类型的大多数队列中，相关性仍然非常显著（图2E）；
（3）EMTI评分
泛癌EMT评分使用16个EMT基因标记计算
患者层面：泛癌TS和EMT评分呈显著正相关；
癌症疾病层面：TS与EMT评分在15种癌症中显著相关，而在14种癌症中不显著相关。
图2 TS亚型与肿瘤类型的干性指数、侵袭性和上皮到间充质转化(EMT)表型的关联
4.基于TS的亚型之间的差异生物途径富集
作者随后使用GSEA分析描述三种TS亚型不同表型背后的生物学和分子差异（图3A和B），所有这些富集通路都标志着癌细胞的高度增殖活性。
5.肿瘤基因组不稳定性分析
（1）基因组不稳定性
作者从以下五个层面分析了TS-CA、TS-CB、TS-CC中的肿瘤不稳定性：TMB（肿瘤突变负荷）、SCNA（体细胞拷贝数改变）、aneuploidy（非整倍性）、LOH（杂合性丢失）、HRD（同源重组修复缺陷）。结果显示：TS-CA亚型表现出最低水平的TMB、SCNA、非整倍体、LOH和HRD，而TS-CB和TS-CC亚型具有较高水平的这些改变。TS-CB与TS-CC之间差异无统计学意义（图3C）。
（2）癌症通路分析
10种致癌途径的特异性改变，在三个TS亚型中，10条通路中有9条显著不同，而只有TGFb通路在很大程度上相似。在包括细胞周期，Hippo, MYC, Notch, NRF2, TP53, PI3K, RTK-RAS和WNT在内的9条通路中，促进致癌活性而失活抑癌功能的基因组改变在TSCB和TS-CC中比在TS-CA亚型中更常见。（图3D）
图3 三种端粒酶评分(TS)亚型信号通路和基因组改变的差异
6.TS亚型间免疫细胞功能差异
作者GSEA分析显示TS与炎症和免疫反应途径之间呈负相关，想探究三种TS亚型肿瘤中浸润免疫细胞的功能是否存在差异。
（1）肿瘤免疫功能障碍和排除(TIDE)评分
TIDE算法是用来预测不同癌症类型的免疫检查点阻断(ICB)应答的工具。TSCB亚型具有最高的髓源性抑制细胞(MDSC)和M2巨噬细胞(M2)评分，而最低的癌症相关成纤维细胞(CAF)评分（图4A）。
（2）使用欧洲基因组-表型组档案（European Genome-phenome Archive，EGA）的患者进行验证
从EGA数据库中选择接受尼伏单抗或依维莫司治疗肾透明细胞癌患者转录组与临床数据，计算每位患者的TS值，单抗根据肿瘤中位TS值将患者分为高TS组和低TS组。尼伏单抗（Nivolumab，PD-1抑制剂）患者中，低TS组患者OS和PFS明显较长（图4B）。其余130例接受MTOR抑制剂依维莫司治疗的患者进行同样分析，但结果提示TS评分既不与OS相关也不与PFS相关。
图4 端粒酶评分(TSs)与癌症免疫逃逸的关系
7.拷贝数变异（Copy number variation, CNV）
（1）在10个端粒酶组分中，TERC拷贝数增加最多，且以其扩增为主，纯合缺失非常少见（图5A和B）；
（2）基于33种癌症类型的非同义突变状态，我们进一步分析了10种端粒酶组分的体细胞突变；总突变频率为4.5%(464/10245个肿瘤)，主要发生在TERT、NVL、RUVBL2、TCAB1, DKC1和RUVBL1（图5C）；
（3）突变似乎是随机的，至少对于TERT和DKC1来说，在损害它们功能的已知位点上没有发生突变（图5D）；
（4）端粒酶成分突变和cna在UCEC中均常见，而cna在LUSC和PRAD中更常见;然而，肺鳞状细胞癌和PRAD分别表现出广泛的扩增和缺失（图5D-F）。
图5癌症类型中10种端粒酶组分的基因组改变
8.TCAB1基因纯合缺失的肿瘤细胞端粒酶活性
分析目的：TCBA1之前被证明是端粒酶运输、组装和功能所必需的，但是在癌症中经常发生纯合性缺失。
作者在CCLE数据集中进一步分析并发现：40%的血癌源性细胞系存在纯合子TCAB1缺失，这些细胞系中TCAB1表达显著降低，使用EXTEND算法分析发现TCAB1缺失和无TCAB1缺失的细胞系之间没有差异。
进一步评估了原发泛癌样本的端粒酶活性，将其分为TCAB1基因heterozygous deletion（杂合缺失）, homozygous deletion（纯合缺失）, no deletion（未缺失），结果显示在大多数癌症类型(21/33)中，三组之间的酶活性无差异。在端粒酶活性有显著差异的12种癌症类型中，虽然TCAB1的纯合和杂合缺失导致基因表达显著降低(图6B 顶)，但EXTEND评分最高更容易出现在杂合缺失组中(图6B 底)。
后续又测定了来自血液系统恶性肿瘤(3个髓系和3个淋巴系)的6个细胞系的端粒酶活性。HL60、KG1和LP1细胞携带TCAB1纯合缺失，其余3种细胞系未发生TCAB1缺失。
（实验验证）
TCAB1纯合缺失和无TCAB1纯合缺失的细胞端粒酶活性。分别采用免疫印迹法(左上)和端粒酶PCR ELISA试剂盒(左下)对6株血液癌细胞的TCAB1和端粒酶活性进行了直接分析。进行了三个独立的实验。结果显示TCAB1缺失细胞的TCAB1蛋白表达水平明显降低，但与未缺失TCAB1拷贝的细胞相比，其端粒酶活性并未降低甚至升高。（图6C）
图6 纯合子TCAB1缺失对癌细胞和原发肿瘤端粒酶活性无影响
9.端粒酶组分的DNA甲基化和m6A调控
除TGCT、DLBC和THYM外，TCAB1在几乎所有类型的肿瘤中均呈负相关。在大多数癌症类型中，DKC1、RUVBL1、NHP2和TERC的表达也与DNA甲基化呈负相关。
对m6A调控剂和TS评分的分析
TS评分与mettll3呈正相关，而与METTL14呈负相关(图7B)。m6a招募了结合蛋白YTHDC1，YTHDC2、YTHDF3和FMR1呈负相关，HNRNPC、HNRNPA2B1、YTHDF1和FMR1呈负相关在大多数癌症类型中，RBMX与TSs呈正相关。
图7 端粒酶组分表达与m6A调控因子和DNA甲基化的关系。
10.靶向端粒酶成分的药物
在CMap（Connectivity Map）数据库中，作者发现23种药物与TSs呈负相关33种癌症类型中≥15种。Bromodomain抑制剂，尤其是BRD4抑制剂，表现出最广泛的活性（图8）。
图8 抑制TS的癌症治疗药物
11.在有端粒选择性延长(ALT)激活或没有端粒维持的肿瘤中的TS评分情况
作者将肿瘤细胞分为ALT阳性肿瘤、TERT阳性肿瘤和双阴性（TERT-/ALT-）肿瘤分类了ALT肿瘤。图9A显示了33种癌症类型中3种不同肿瘤的分布。双阴性肿瘤的TSs最低，而TERT+肿瘤的肿瘤最高，双阴性肿瘤与TERT+肿瘤或ALT+肿瘤之间有统计学差异（图9B）。TERT+肿瘤中TS评分高于ALT+肿瘤，但差异无统计学意义（图9B）。桑基图进一步显示了这些肿瘤和TS亚型之间的关系：TS-CB和CC亚型主要来自TERT+肿瘤，TS-CA来自TERT+和双阴性肿瘤，而ALT+肿瘤均匀分布在三个TS亚型（图9C）。
图9 端粒酶评分（TS）与33种癌症类型的TERT+、替代端粒延长（ALT）+和TERT-/ALT-肿瘤的相关性
讨论
本文以端粒酶的组成成为线索，利用TCGA数据库一步一步探索他们在泛癌中的表达情况并构建亚型与端粒酶评分，随后又分析了不同亚型以及评分与肿瘤干性指数、肿瘤侵袭性、EMT的关系，紧接着分析了亚型通路富集情况、免疫逃逸情况。在免疫逃逸情况方面，作者并用其它数据库对免疫情况进行并在数据库中确定了靶向药物。整篇文章思路严谨，环环相扣，很值得学习。
参考文献
Wang J, Dai M, Xing X, Wang X, Qin X, Huang T, Fang Z, Fan Y, Xu D. Genomic, epigenomic, and transcriptomic signatures for telomerase complex components: a pan-cancer analysis. Mol Oncol. 2023 Jan;17(1):150-172. doi: 10.1002/1878-0261.13324. Epub 2022 Oct 31. PMID: 36239411; PMCID: PMC9812836.
