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基因编辑系统是基于古细菌抵御外源核酸入侵的免疫机制为基础开发出来的一种新型的基因编辑技术。相对于传统的基因编辑技术(sRNAi等)，该技术具有更加高效、操作简单、细胞毒性小等特点。目前，CRISPR/Cas9基因编辑技术已在肿瘤研究的诸多方面中得到应用，如肿瘤相关基因的功能、构建动物肿瘤模型、筛选肿瘤细胞表型及耐药相关基因以及肿瘤的基因治疗等诸多方面。
随着技术的进步，描绘不同组织在空间结构上的细胞异质性和发育动态，是肿瘤研究的一个新方向。每个细胞都和临近细胞有着相似的转录组或基因组特征，但多细胞排列在一起，却能阐述复杂多变的时空模式。
这里，我们介绍新发在Cell的一篇文章《Spatial CRISPR genomics identifies regulators of the tumor microenvironment》[IF:66]，作者开发了一种新的空间功能基因组学算法——Perturb-map，用于在小鼠的肺癌模型中敲除基因，同时评估每个基因敲除后如何影响肿瘤生长、组织病理学和免疫成分。同时，将Perturb-map和空间转录组学配对，以对 CRISPR 编辑的肿瘤进行无偏分析。
一、背景
空间分辨率的单细胞和区域测序表明，遗传上不同的亚克隆，可能存在于肿瘤临近，并且可以具有不同的肿瘤微环境；然而，特殊基因是如何影响肿瘤微环境的？邻近的克隆是怎么影响其他克隆的，这些问题尚没有确切的定义。虽然已经确定了一些参与协调肿瘤微环境的基因，但许多基因在影响不同肿瘤的结构和免疫组成方面的潜在作用尚未确定。
识别控制细胞排列的基因是一项挑战，肿瘤微环境的组成是复杂的，许多不同类型的免疫和非免疫细胞的比例、位置、运动都是相互依赖的因素。很多基因的功能是依赖于组织背景以及与特定细胞类型和结构的空间邻近性。因此，确定肿瘤中表达的数百个基因中的哪一个会影响肿瘤微环境(TME)的组成和分布，需要进行体内研究。
为了扩大基因功能的研究，pooled CRISPR筛选越来越多的用于单细胞测序方法【Fig.S1】，如Perturb-seq；高维细胞术通过更全面地测量由基因扰动引起的分子和表型变化，进一步推进了CRISPR筛选。
Ref：Shalem O, Sanjana NE, Zhang F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nat Rev Genet. 2015 May
然而，虽然pooled筛选方法可以实现高通量，但现有技术在体内研究方面存在局限性。如，分离组织进行分析。这在很大程度上限制了可以通过pooled筛选探测到的细胞内在过程的生物学功能，因为一旦组织均质化，就无法评估基因扰动的细胞外效应。
这里，作者描述了一种体内的空间功能基因组的方法，叫做Perturb-map。该方法基于一种蛋白质barcode系统——Pro-Code，使用少量线性表位的三联体组合，创建一组更高阶的独特barcode，标记表达不同的CRISPR gRNA细胞。因此该方法可以在单细胞分辨率和组织规模的肿瘤内检测到120种不同的Pro-Code表达的癌细胞群。作者在肺癌小鼠模型中使用Perbturb-map并行敲除35个基因，同时评估每个基因敲除后如何影响肿瘤生物学的关键参数，如生长、组织病理学、免疫组成和分子状态。
二、数据和代码
数据：
代码：https://github.com/srose89/PERTURB-map
三、Highlights
四、结果
1.通过多重成像原位检测肺和乳腺肿瘤中的 120 个 Pro-Code 群体
在先前的研究中，作者描述一个基于蛋白质的细胞bar-coding系统——Pro-Codes。该系统由支架蛋白、dNGFR融合的线性表位的三联体组合组成。由于ProCodes可以被抗体检测到，作者假设可以通过成像来解决。为了测试这一点，生成表达Pro-Codes的癌症线。使用一组编码84或120个不同Pro-Codes的慢病毒载体 (LV) 转导小鼠的肺癌细胞 (KP细胞系) 和乳腺癌细胞 (4T1细胞系) 。
然后，作者在小鼠静脉中注射KP细胞，或者在乳腺脂肪垫中注射4T1细胞。经过两周后，在注射4T1细胞的搜集负瘤组织；4周之后，在注射KP细胞的小鼠中收集负瘤组织。使用之前开发的用于高维成像的方法——MICSSS(单张载玻片上的多重免疫组织化学连续染色)，对每个 Pro-Code 表位进行染色。或者，在组织切片在多路离子束成像 (MIBI) 上成像。
这两种技术都可以在亚细胞分辨率下有效地检测每个表位，因为可以检测细胞膜上的表位，正如膜定位 dNGFR 支架所预期的那样。 因此，能够在空间上解析乳房[Fig.1ab]和肺[Fig.1c]肿瘤模型中的多达120个Pro-Code。
利用核定位mCherry荧光蛋白作为支架创建了一组新的165个Pro-Codes，证实了CyTOF对每个核Pro-Code(nPC)的检测。接下来，作者使用120个nPC转导4T1和KP细胞，重复上述实验。结果表明，能够在肺和乳腺肿瘤模型中检测到120个独特的nPC中的每一个，并发现它们定位于细胞核[Fig.2a]。
由于膜结合的Pro-Codes(memPC)和核Pro-Code(nPC)具有不同的亚细胞定位，作者假设可以在相同的细胞中组合使用它们。使用56 个memPC的库转导4T1，对dNGFR+细胞进行分类，然后使用相同的56个nPC库再次转导。作者发现，相同细胞中，可以在细胞核和细胞膜上识别不同的ProCode。
2.Pro-Code 成像显示KP肺和4T1乳腺肿瘤的克隆性
通过对两种肿瘤类型的Pro-Codes进行成像，确定了一个非常明显的差异——与 KP 肺癌相比，4T1肿瘤呈高度异质化分布。肺癌中，几乎所有的肿瘤病灶都是克隆性的。这暗示着每个KP肿瘤病灶都是由单个KP癌细胞引发的。
为了进一步分析克隆动力学，作者在细胞分割、Pro-Code分配和2D数字重建后，评估4T1原发性肿瘤和KP肿瘤病灶内Pro-Code群体之间的共定位。对于每对 Pro-Code 群体，相对于细胞标签的随机交换，基于观测到的相邻的相互作用的数量，计算一个Z-score。 Zscore证实KP肿瘤是高度克隆的，因为每个Pro-Code群体都表现出相对频繁的同型相互作用[Fig.2b]。尽管4T1细胞似乎是随机分布的，但共定位分析也显示出一定程度的克隆性。
为了解区域聚集是如何形成的，作者使用核密度估计来可视化Pro-Code阳性细胞的相对区域丰度[Fig.2cd]。接下来，使用Pro-Code来评估4T1转移的克隆异质性。将nPC-4T1注射到乳腺脂肪垫中以产生乳腺肿瘤。四周之后，为了允许肺转移，收集Pro-Codes的肺和染色切片[Fig.2e]。
结果发现，对于单个Pro-Code，许多转移灶是同质的，表明它们起源于原发肿瘤的单个细胞。 然而肺中也存在包含Pro-Code表达细胞混合物的转移性病灶，这表明多细胞接种或克隆的初始接种随后是额外的转移细胞。
作者比较KP肺、乳腺4T1和肺中4T1转移细胞的克隆异质性[Fig.2f]。证实了每种肿瘤背景的不同空间模式，KP肺肿瘤具有高克隆性和低混合性，4T1原发性肿瘤具有弥漫性克隆性，肺中的4T1转移瘤呈克隆性发展，但相互作用密度也具有双峰模式，反映了混合转移的存在。
3.Perturb-Map确定了对免疫编辑和肿瘤结构敏感性的调节因子
CRISPR筛选帮助确定了一些与癌症免疫有关的基因，但如前所述，目前的方法不适合研究肿瘤免疫学的许多关键方面，例如免疫细胞募集和排除。这里，作者尝试使用Pro-Codes创建一个用于原位解析CRISPR筛选的平台。
作者构建了一个nPC/CRISPR慢病毒载体库，靶向35个基因，包括编码细胞因子信号通路的调节因子；参与免疫细胞相互作用的配体和分泌因子等[Fig.3a]。虽然，已知这些基因具有免疫功能，但它们在肺的肿瘤微环境生物学中的作用尚未完全确定。 作为对照，靶向KP细胞不表达的F8基因。 对于35个基因，使用三种不同的慢病毒转导KP-Cas9，每个载体表达相同的nPC，但不同的gRNA靶向相同的基因。通过CyTOF对文库中特定CRISPR的直接或下游靶标的表型分析，表明有效敲除了同源基因。
CRISPR-Cas9一般设计：
CRISPR在敲除基因的时候，需要两个成分：Cas9核酸酶和gRNA(guide RNA）。
Cas9和gRNA会形成一个Cas9核糖体蛋白，这个核糖体蛋白能结合到基因组上的靶序列上。 针对要敲除的某个基因，CRISPR文库通常包含几种gRNA，处理大量细胞，使每个细胞（平均）受到单个gRNA的影响。
用慢病毒蛋白对含有gRNA质粒进行包装，转染目标细胞，然后用嘌呤霉素进行筛选，转染成功的细胞，DNA上会携带一个gRNA片段（说明该gRNA保留在了细胞中）；
对转染成功的细胞进行培养，设置不同的时间点，提取细胞的DNA，对sgRNA进行PCR扩增，然后通过高通量测序，检测sgRNA的read count；
实验会设计多个timepoint来观测sgRNA的read count的变化， 根据不同timepoint上sgRNA read count的不同，分析基因敲除后，对于该细胞生长、增殖的影响。
对Cas9表达的小鼠静脉注射细胞以播种肿瘤；4 周后，收集肺组织进行肿瘤分析[Fig.3b]。通过MICSSS 对组织进行切片和染色以用于Pro-Code。对于每个样本，用H&E或Pro-Code表位标签特异性抗体对连续切片进行染色[Fig.3cd]。 然后对图像进行分割和去条形码，以识别每个肿瘤病灶表达的Pro-Codes(Fig.3e)。
使用基于密度的噪声应用空间聚类(DBSCAN)算法将Pro-Code群体亚聚类为离散病灶，并使用alpha形状推断肿瘤边界，然后进行手动管理(Fig.3e)。
为了确定体内是否有任何靶向基因影响肿瘤发育，作者比较了携带特定 nPC/CRISPR 的肿瘤比例与预注射细胞混合物中相同 nPC/CRISPR 的相对频率[Fig.3f]。
两个最耗竭的基因靶点是免疫检查点Cd274(Pd-l1)和Cd47；相反，B2m靶向病灶显着富集。同时作者观察到一个CRISPR靶向干扰素信号IFNγ的正调节因子去富集现象，以及CRISPR靶向Socs1的富集，Socs1是IFNγ信号的负调节因子。值得注意的是，Tgfbr2靶向病灶在体内最丰富，表明KP细胞上TGFb 受体的缺失增强了肿瘤生长[Fig.3g]。
除了能够测量与基因敲除相关的肿瘤病灶的数量和面积外，Perturb-map还可以评估不同基因如何影响肿瘤结构。为此，病理学家根据一系列临床准则对每个病灶进行评分，这些标准包括癌细胞的分化程度、病灶的位置和基质的组成。根据包括坏死、纤维化和分化在内的特征组合确定不同的肿瘤组织学类型。使用卡方检验以确定基因扰动与病灶组织学特征之间的显着关联[Fig.3h,3i]。这些研究表明，Tgfbr2 和Socs1 的缺失以截然不同的方式改变了 KP 肺肿瘤的结构，但每一种都赋予了肿瘤生长优势。
4.Perturb-Map识别调节TME免疫组成的基因
使用Perturb-map来研究肿瘤内和肿瘤周围，不同的基因扰动是如何影响免疫细胞的募集和维持。
除了量化免疫浸润外，作者还评估了每个肿瘤病灶内免疫细胞的空间分布[Fig.4f]。 然而在特定的基因的敲除病灶中存在显著差异[Fig.4i,4k]。
由于Socs1敲除导致KP细胞上更高的PD-L1，作者假设局部T细胞功能障碍可能与观察到的 Socs1敲除肿瘤的富集相一致。 为了测试这一点，分别给小鼠注射1:1混合的KP-Cas9-F8-gRNA和KP-Cas9-Socs1-gRNA细胞，并用抗PD-L1或同种型对照抗体处理。
转移性病变可以演变出不同的分子状态，甚至在单个肿瘤块内，遗传亚克隆也可以形成具有不同TME组成的空间不同区域； 然而，相邻的遗传异质区域如何相互影响尚未得到很好的探索。 作者试图使用Perturb-map来研究相邻肿瘤是否影响彼此的免疫浸润。
这些结果表明，至少在SOCS1和TGFb通路改变的情况下，在彼此紧密接触的肺肿瘤病灶中，免疫细胞的组成和空间排列非常局部地形成。 尽管这可能取决于特定的分子改变，因为某些基因表达变化可能会产生更远的影响，但Perturb-map可以提供一种缩放方法来评估特定的基因改变如何影响局部、近端和远端TME状态。
5.Perturb-Map空间转录组识别扰动相关的分子特征
为了进一步确定不同基因扰动对肿瘤状态的影响，作者将空间转录组与Perturb-Map结合。
1. 首先，对于4个接种nPC/CRISPR的小鼠肺的切片，使用10X技术测序。通过K-means聚类方法将样本聚类，然后识别不同类的差异表达基因，区分肿瘤病变相对应的空间区域的特异的基因特征[Fig.5a]。结果发现，与周围健康的肺组织相比，肿瘤病变区域高度表达特定的角蛋白和上皮标志物；以及在KP病灶中发现IFNg特征。
2. 在肿瘤群体中清晰且特异性地捕获了Pro-Code转录本[Fig.5b]。由Pro-Code转录本定义的对肿瘤位点的基于图形聚类，揭示了肺切片中不同且重复的肿瘤基因表达特征[Fig.5c]。和KP肿瘤的克隆发展一致，给定病灶相对应的空间位置通常聚集在一起，但也有与其他病变明显聚集在一起的特定病灶。
3. 为了识别每个病灶中的基因扰动，作者通过成像质量流式细胞术对使用金属结合抗体染色的肺组织切片进行成像。基于组织内nPC/CRISPR的鉴定使用相应的基因扰动注释每个基因特征，并揭示与其他KP肿瘤相比，携带CRISPR靶向Tgfbr2或Ifngr2的肿瘤呈现出不同的基因特征[Fig.5d]。
4. 在敲除Tgfbr2肿瘤中，许多相同的ISG也被下调，可能是由于肿瘤的T细胞排除状态，并且各种胶原蛋白编码基因增加。然而，很多上调的基因表明，TGFβ信号增加[Fig.5d,5e]。
5. Tgfbr2肿瘤中，TGFb诱导的基因促使我们测试KP/Tgfbr2 CRISPR细胞对TGFβ的反应性。证实它们没有响应TGFβ激活TGFβ信号传导，并且TGFBR2在这些细胞中确实被功能性敲除。
6. 因此，我们试图了解TME中哪些细胞类型，Tgfbr2敲除可能对 TGFβ有反应。 使用CytoSig数据库。在相关治疗和细胞类型对之间创建代表性基因集，然后进行GSEA识别不同肿瘤簇中的这些特定细胞因子特征[Fig.5g,5f]。
这些发现表明，KP肺癌细胞上Tgfbr2缺失的结果是肿瘤中TGFb表达增加以及TME中TGFb通路激活。 这表明在Tgfbr2敲除病灶中观察到的基质重塑和免疫排斥的潜在机制是癌症相关成纤维细胞的TGFβ激活。
6. 验证Tgfbr2的缺失导致更具侵袭性和T细胞排除的KP肺肿瘤
作者试图确认与敲除Tgfbr2肿瘤相关的Perturb-map表型。为此，作者用靶向 F8(对照)或Tgfbr2的慢病毒编码gRNA转导KP-Cas9细胞并通过静脉注射细胞进入小鼠。分别在注射后 7、14 和 28 天采集肺并检查肿瘤负荷。
1. 在注射后7天内就可以发现，与对照相比， 敲除Tgfbr2的肿瘤更大、更丰富。该现象在后来更加明显。
2. 与Perturb-map 中观察到的相似，许多Tgfbr2肿瘤具有纤维粘液基质[Fig.6b]。通过阿新蓝染色严重了这一现象[Fig.6c]。
3. 此外，正如在Perturb-map筛选中观察到的，Tgfbr2 肿瘤内的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞浸润显着减少[Fig.6d,6e]。 这证实了Tgfbr2的缺失重塑了KrasG12D p53null的肺肿瘤的TME。
五、结论
该研究建立了一种功能基因组学方法，能够通过多重成像和空间转录组学在组织内解决pooled CRISPR筛选。Perturb-map的一个关键进步是，它拓宽了可以在功能基因组筛选中研究的基因类型和基因功能。大多数基于测序的pooled筛选方法需要分离细胞或组织，这会导致有关扰动如何影响细胞局部环境的信息丢失。通过对组织中的Pro-Codes 进行成像，使我们能够评估不同的基因扰动如何不仅改变了肿瘤的播种和生长适应性，而且还改变了肿瘤形态和免疫细胞募集。
除了研究特定基因功能之外，Perturb-map还使我们能够检查特定基因扰动和相关表型如何影响邻近的肿瘤区域。这是肿瘤生物学中一个相对未被充分探索的领域，但随着越来越多的高分辨率研究报告了TME的异质性以及与肿瘤遗传学的关联，Perturb-map可以为因果研究提供一种有价值的手段，以确定特定基因如何影响肿瘤的局部和远端区域。
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