在当前肿瘤研究中，肿瘤免疫微环境已成为重要的关注点。不过传统组织测序方法不能有效识别和刻画肿瘤微环境中各个免疫细胞的种类及其所处状态。而单细胞具有更高的分辨率，因此越来越多的研究试图将单细胞与组织相结合来探索肿瘤微环境。今天小编给大家分享一篇2022年12月发表在GENOME BIOLOGY（IF:17.906）杂志上，结合单细胞及bulk数据研究胃癌肿瘤免疫微环境的文章。

Parallel single-cell and bulk transcriptome analyses reveal key features of the gastric tumor microenvironment

单细胞和组织转录组并行分析揭示胃癌肿瘤微环境的关键特征

一．文章背景

胃癌是全球第五大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因。此外，研究已经发现肿瘤微环境(TME)在多种癌症中显著影响患者的治疗结果及临床结局。不过胃癌中组成TME的细胞还没有被广泛地研究，因此该文章将单细胞和组织转录组数据进行并行分析，并揭示了胃癌肿瘤微环境的关键特征。

二．文章摘要

研究对24例未经治疗的胃癌患者的肿瘤及癌旁组织的单细胞及组织RNA测序数据进行了分析，并通过聚类非上皮细胞识别出胃癌TME中的81种细胞类型。研究发现胃癌中激活的成纤维细胞和内皮细胞过表达。此外，研究通过细胞间网络重构和生存分析发现免疫抑制髓系细胞亚群和调节性T细胞与患者抗PD_1治疗应答缺乏和不良预后有关，而IFNγ激活的T细胞和表达HLA-II的巨噬细胞与治疗应答和总生存率增加有关。

三．文章的主要内容及结果

1.  胃癌的肿瘤微环境

文章首先对胃癌的肿瘤微环境（TME）进行了整体刻画。研究对24例未经治疗的胃癌患者的肿瘤和癌旁样本进行组织RNA测序(RNA-seq)和全外显子组测序以及单细胞RNA-seq (scRNAseq)测序(图1a)。接着为了识别构成胃癌TME的细胞类型，研究使用scRNA-seq数据，将96623个细胞聚类为11种主要细胞类型，并进一步分为81种亚型(图1b)。作者根据标记基因的表达对主要细胞亚群进行了注释，主要识别出B细胞、浆细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、NK细胞、髓系细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞、壁细胞、胶质细胞及上皮细胞(图1c)。

2.     肿瘤间质存在活化的成纤维细胞

在这一部分作者对成纤维细胞和壁细胞进行了进一步分析。研究先将16492个成纤维细胞和壁细胞重聚类，识别出15个细胞亚群(图2a)，结果发现壁细胞与成纤维细胞明显分离。研究对单个细胞亚群进一步观察发现，每个细胞亚群有多个特异基因，突显出胃成纤维细胞和壁细胞的异质性(图2b)。此外，研究也对恶性和非恶性样本的成纤维细胞亚群进行了比较分析，结果发现胃癌TME中静息成纤维细胞亚群急剧减少(图2b)。

3.     CTHRC1阳性成纤维细胞特异基因的表达与不良预后有关

在这一部分作者对成纤维细胞特异基因的表达与临床结局的关联进行了分析。作者整合组织和单细胞RNA-seq数据识别出各个细胞亚群中具有不同表达模式的上调(U)和下调(D)基因模块，结果发现多个上调和下调的基因模块在单个成纤维细胞亚群中特异性表达(图 2c)，其中U7与成纤维细胞增殖、基质重塑和细胞迁移相关(图2d)。此外，研究也发现来自U7的所有基因均在F13- CTHRC1激活的成纤维细胞中特异性表达，并且与较差的生存相关(图2e)。

4.     肿瘤内皮细胞将免疫吸引力转换为血管生成通路

这一部分研究对胃癌中的内皮细胞进行了详细分析。作者对数据中的3684个内皮细胞进行重聚类识别了9个亚群对应于6种不同的内皮细胞亚型(图3a)，分别与动脉、毛细血管、未成熟内皮细胞、尖端细胞、淋巴细胞和静脉细胞相关(图3b)。随后研究对内皮细胞特异基因进行富集分析发现两类内皮细胞中的血管生成和细胞运动反应通路增加，而抗原呈递和免疫防御相关功能减少，表明胃癌中内皮细胞的免疫细胞吸引力降低(图3c)。由于血管新生对肿瘤持续生长至关重要，因此作者推测这些细胞类型可能与较差的生存有关，结果研究在TCGA胃癌队列也确实观察到SERPINE1表达与生存急剧恶化有关（图3d）。

5.     巨噬细胞展示出炎症二分类

研究在这一部分对胃癌TME中的髓系细胞进行了详细刻画。研究将数据集中的10546个髓系细胞重新聚类识别了15个亚群，并将这些亚群注释为巨噬细胞、树突状细胞或中性粒细胞(图4a)。接着研究通过特异表达基因将巨噬细胞亚群确定为促炎和抗炎或组织驻留巨噬细胞(图4b)。研究也发现髓系细胞在胃癌TME中急剧增加，只有组织驻留巨噬细胞在健康胃组织中升高（图c）。研究也发现促炎和抗炎基因特征的表达在所有患者样本中均呈负相关(图4d)。在TCGA胃癌队列中，研究也观察到抗炎特征与不良预后显著相关(图4e)。

6.      淋巴细胞向免疫抑制型和分化型转移

接下来研究对胃癌中的淋巴细胞进行了进一步分析。研究首先观察到CD8⁺ T细胞比例在肿瘤和正常样本中几乎没有差异，而CD4⁺ T细胞在胃肿瘤样本中显著增加。接着作者将12905个CD4⁺ T细胞重新聚类为8个亚群，然后将这些亚群注释为6种辅助性T细胞亚型，包括调节性、naïve、中央记忆(CM)、效应记忆(EM)和滤泡辅助性T细胞(图5a)。此外，研究也将31705个CD8⁺ T细胞和2658个NK细胞聚成13个亚群，其中12个亚群对应8种不同的CD8⁺ T细胞亚型，1个亚群对应NK细胞亚型。研究观察到这些CD8⁺ T细胞分别被注释为naïve、效应细胞、效应记忆细胞、表达CD45RA的效应记忆细胞、驻留记忆细胞、耗竭性、上皮内细胞和具有三级淋巴特征的CD8⁺ T细胞 (图5b)。

5. 细胞通讯网络揭示胃癌发生发展的潜在驱动因素

这部分研究对胃癌肿瘤微环境中的细胞相互作用进行了分析。研究基于单细胞数据中的配体和受体表达信息构建了细胞通讯网络。研究发现胃癌微环境在不同的细胞亚型之间存在广泛的交流，其中F13-CTHRC1与许多细胞亚型显著相关(图6a，b)。研究也发现许多在胃癌中上调的基因参与了F13-CTHRC1以及内皮细胞特异性的相互作用，而下调的基因没有，这进一步表明了肿瘤特异性细胞通讯程序的存在(图6d)。此外，研究也观察到F13-CTHRC1不仅能通过刺激血管生成促进肿瘤重构，还可能推动抗炎巨噬细胞的发展(图6c)。

6. 胃癌TME中的配体受体相互作用揭示了免疫逃避机制

研究在这一部分对胃癌TME中的7210个上皮细胞进行了详细分析。作者将这些细胞聚类成15个亚群，随后通过copyKAT算法识别出恶性细胞。接着研究在细胞互作网络中观察到恶性细胞亚群与多种其他细胞类型关联(图6A)，主要的相互作用细胞类型是CD8⁺ T细胞、中性粒细胞和成纤维细胞。其中EP11-CLDN7和CD8⁺ T细胞之间的相互作用以LGALS9-HAVCR2和HVEM-CD160的相互作用为主，这两者都是众所周知的抑制CD8⁺ T细胞功能的检查点，这表明胃癌肿瘤细胞具有免疫抑制功能。

7. 细胞类型特征可预测患者预后

这一部分研究分析了不同细胞亚群对患者预后的影响。研究使用单细胞数据作为参考，根据CibersortX推断TCGA样本中每种细胞亚型的比例，随后评估了每种细胞亚型比例较高和较低的患者之间的生存差异，结果观察到F13-CTHRC1和EN10-SERPINE1细胞比例较高的患者生存时间显著缩短(图7a, b)。相反，树突状细胞cDC1比例则对患者生存有显著的正面影响(图7c)。此外，作者在通讯网络分析中发现M16-CLEC9A通过多种通讯信号与CD8⁺ T细胞和NK细胞群相互作用，其中最显著的是XCL1/ XCL2-XCR1受体-配体轴(图7d)。因此，结合这些负相关特征，研究在F13富集/M16缺失患者和F13缺失/M16富集患者之间观察到更显著的生存差异(图7e)。

8. 整合免疫治疗的胃癌组织RNA - seq数据揭示影响应答的细胞及分子

在研究的最后一部分，作者对导致免疫检查点抑制(ICI)治疗耐药的细胞类型和TME信号通路进行了分析。研究收集了45例接受抗PD -1治疗患者的组织RNA-seq数据，其中包括12例应答患者和33例未应答患者。接着研究通过差异表达分析发现在12例有反应患者和33例无反应患者的样本中，分别有696个和1382个基因显著高表达(图8a)。接着研究在单细胞数据中根据应答相关的基因进行聚类，结果识别出8个应答基因集及4个非应答基因集（R1-R8，NR1-4，图8b）。研究也发现这些基因集中包含一些显著的细胞标记基因，提示这些细胞对免疫治疗应答产生影响(图8c，d)。接下来为了进一步研究在胃癌TME中发现的11种主要细胞类型或81种亚型中是否有任何一种可用于预测免疫治疗应答，作者基于每种细胞类型的标记基因构建了二元分类模型预测治疗结局，结果发现T27周期CD8⁺ T细胞预测治疗结局的效能最优(图8e)。

到这里这篇文章的主要内容就介绍完了。文章将组织数据及单细胞数据结合进行分析，对胃癌的肿瘤微环境进行了全面刻画。研究对胃癌微环境中主要细胞类型的基因表达、功能、通讯及对生存和治疗应答的影响进行了分析，做单细胞的小伙伴可以参考这种思路。