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“滴血验癌”之ctDNA如何真正发挥临床价值？
哈喽，大家好，听说过“滴血验癌”这种黑科技吗？是惊天骗局？还是医学奇迹？今天小编就和大家谈谈这个话题，用事实说话！我们先详细解读1篇近期刚发表在《Nature Communications》杂志上的文章，题目为“Circulating tumor DNA reveals complex biological features with clinical relevance in metastatic breast cancer”。通过这篇文章的学习，相信大家会对ctDNA在乳腺癌中的临床价值有所了解。在推文的最后，小编还会给大家分享几篇关于ctDNA在不同肿瘤类型中的最新研究，希望能抛砖引玉，对大家有所启发。
导读
基因组测序为精确肿瘤学带来了许多新的生物标志物和治疗可能。体细胞基因突变、扩增和基因融合检测可以在多种癌症类型中提供靶向治疗的靶点。早在1948年，研究人员就发现我们细胞内的DNA并不是都呆在我们的细胞核内，这些DNA也会游离到血液中来，这些在血液中的DNA被称之为“细胞游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）”，包括正常细胞释放到血液中DNA，也包括肿瘤细胞释放到血液中DNA。顾名思义，肿瘤细胞释放到血液中的DNA，随血液在全身循环，故被称为“循环肿瘤DNA（circluting-tumor DNA，ctDNA）”。对血液样本中的肿瘤DNA（如ctDNA）进行测序（即液体活检），能够在任何给定时间内获得一些基于肿瘤的遗传信息，这种方法可避免实体肿瘤侵入性活检及相关并发症。目前“滴血验癌”的检测原理，正是通过检测血液中的ctDNA，来检测癌症信号。
虽然，鉴定单个肿瘤的DNA变化在临床上可行，但癌症是高度复杂性疾病，除了在临床上鉴定肿瘤DNA改变，往往还需要额外的生物学信息来完善患者预后、预测治疗获益。在癌症早期，基于多基因转录组信息的预后检测是有效的，并被临床指南所推荐；在癌症晚期，基于转录组的分析正成为一种有前景的预后和预测工具。遗憾的是，晚期癌症患者的组织样本不易获得，此外，转移器官或部位的类型可能会影响从转录组中获得的表达模式，不能反映患者肿瘤的异质性。
为解决上述难题，2019年，西班牙IDIBAPS生物医学研究所的作者报道了一种基于监督学习的综合计算方法，其利用来自DNA拷贝数改变（CNA）的数据预测基于RNA的肿瘤表达特征值。具体而言，作者发现了150个基于DNA的多特征标签，可追踪各种乳腺癌生物学过程，具有较高的预测性能。这一发现为使用血液中ctDNA信息来获取单一基因改变和肿瘤部分以外的临床相关信息提供了可能。
今天分享的这篇文献正是该团队延续了前期的工作，进行了更深入的分析，从而证明复杂的肿瘤表型特征可以在ctDNA中被识别，并可能与晚期乳腺癌的临床相关。基于ctDNA的多基因标记方法为发现和鉴定生物标志物开辟了潜在途径，特别是在液体活检变得普遍的晚期疾病场景中。
知识补充
乳腺癌是一种非常复杂的疾病，因此也产生了非常多的专业名词，为了便于非乳腺癌领域的小伙伴理解，在进入正文之前进行简单知识补充，熟悉乳腺癌的小伙伴可直接略过本节。
1.乳腺癌分型
被诊断乳腺癌后，最重要的问题之一，就是知道到底是哪一种乳腺癌。具体而言，就是要知道分型和分期。乳腺癌的分型有两大方法，一是病理分型，二是分子分型。
2.基于ER、PR、HER2及Ki67的临床分型
雌激素受体 （ER）、人类表皮生长因子受体 2（HER2）、孕激素受体（PR）是常见乳腺癌免疫组化指标，也是最经典的乳腺癌分型系统。根据它们表达的阳性和阴性，形成了不同的组合，如下。
理论上，根据3个基因的表达状态不同，应该有2x2x2=8种，分为三阴性、三阳性、二阳性（3种），一阳（3种），但这种分型方法临床意义不大，因此较少用。
实际情况是，ER和PR合称激素受体（HR），乳腺癌被分为3种，
不难看出，除了上述5种（1+1+3）情况，还有3种情况目前在临床上并没有被明确定义（即表格中没有着色的部分）。临床上根据PR表达水平高低，进一步将HR阳性分为Luminal A型（PR高表达，PR++，＞20%）和Luminal B型（PR低表达，PR+或PR-，＜20%）。有趣的是，三阳性乳腺癌也被定义为Luminal B型。
此外， Ki-67 （增殖指数）是与细胞增殖有关的指标，阳性率越高，肿瘤生长越快，组织分化越差，对化疗也越敏感。Ki-67是Luminal A和B型分类诊断的关键，Ki-67<14%为低表达。所以针对Luminal A/B分型来讲，最准确的评判标准应如下图：
3.基于PAM50分型
PAM50全称是“Prediction Analysis of Microarray 50”，2009年由Parker提出的[1]，只需要测定50个基因的表达量即可对乳腺癌病人进行初步分类（具体是哪50个基因，感兴趣的小伙伴可以自行查阅，此处不赘述）。PAM50可揭示传统分子分型中的ER和HER2异质性问题，但因为PAM50分子分型需要使用芯片技术，价格昂贵以及未在国内授权等原因，目前在国内临床实践中应用较少。
PAM50乳腺癌分型:
Luminal A(管腔A型)：激素受体阳性、HER2阴性、低表达Ki-67。肿瘤进展慢，有相对更好的预后。
Luminal B(管腔B型)：激素受体阳性、HER2阳性或阴性、高表达Ki-67。肿瘤进展比管腔A型快，预后稍差。
Basal-like(基底样)：激素受体阴性、HER2阴性。在年轻和非裔美国女性患者中普遍存在BRCA1基因突变。
HER2-enriched (HER2富集型)：激素受体阴性、HER2阳性。比管腔型进展快，预后差。但通常使用靶向HER2蛋白的药物后有良好的治疗效果。
4.分型、治疗与预后
不同类型的乳腺癌，无论从治疗方法，还是预后都是非常不同的。以最经典的基于ER、PR、HER2的临床分型为例：
1）激素受体阳性乳腺癌（HR阳性乳腺癌）：乳腺癌中最常见的一类，占60%~70%，也是发展最缓慢的一种亚型，整体预后较好。治疗方法主要采用手术+化疗+内分泌治疗。因为这类乳腺癌的生长离不开激素，因此通过药物抑制体内雌激素活性，通常能很好地抑制癌症生长。最常用的药物是抗雌激素（比如他莫昔芬）或芳香化酶抑制剂。
2）HER2阳性乳腺癌：占乳腺癌的20%，这种亚型的乳腺癌过量表达癌蛋白HER2。这种类型比上一种生长更快，也更容易转移。对于这类病人的治疗通常是手术+化疗+HER2靶向药治疗。
3）三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）：最少见，大概只占10%，但这是最让人头痛的一类，预后最差。一方面，它激素受体或HER2都是阴性，因此内分泌治疗和HER2靶向治疗对它都无效，一般只能靠化疗药物，效果不理想。另一方面，它又恰巧是所有乳腺癌中最恶性的一种，发展迅速，容易转移和复发。
5.CDK4/6抑制剂治疗
CDK4、CDK6是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶，在某些情况下，CDK4、CDK6过渡表达，导致细胞过度增殖（肿瘤发生）。因此一旦CDK4、CDK6过度表达时，即在人身上出现肿瘤：比如乳腺癌。抗乳腺癌思路之一就是：通过抗CDK4、CDK6来抑制细胞进入增殖周期，达到抑制肿瘤细胞增殖的目的，即针对CDK4、CDK6的靶向药物——CDK4、CDK6抑制剂。
假如病人得了乳腺癌，免疫组化提示：CDK4、CDK6过表达，则可通过CDK4、CDK6抑制剂达到抗肿瘤作用。当然不是所有的CDK4、CDK6阳性病人都可选择CDK抑制剂治疗。我们还是以ER、PR、HER2的临床分型为例：
1）激素受体阳性乳腺癌，尤其是ER阳性：内分泌治疗是主要手段之一，内分泌治疗在某些情况下回产生耐药，而研究表明CDK4/6可能是逆转ER阳性乳腺癌患者内分泌耐药的潜在治疗靶点。
2）HER2阳性乳腺癌： 迄今还没有相关的临床研究数据能够证实CDK4 /6抑制剂在 HER-2阳性乳腺癌患者中的确切疗效。
3）三阴性乳腺癌（TNBC）：CDK4 /6抑制剂对大部分 TNBC 患者的疗效并不佳。 目前为止还没有足够证据能够证明， TNBC 患者可从CDK4 /6抑制剂的治疗中获益。
可见，CDK4 /6抑制剂目前主要用于ER+ /HER2-患者，一线内分泌治疗本身就可给部分患者带来较好的临床预后，并且毒副反应较小，而联合CDK4/6抑制剂提高疗效的同时，也必将增加了毒副反应及治疗成本，因此对此类患者选择CDK抑制剂时需权衡利弊。
数据来源
为了证明ctDNA可以追踪复杂的肿瘤表型，将150个先前定义的基于DNA的多特征标签应用于Plasma-1队列，该队列数据集其由246个血浆样本组成，进行0.5X浅层全基因组测序（shWGS）。其中，大多数样本（n = 209）来自174例晚期HR+/HER2-乳腺癌患者。除此之外，还有其他临床亚型的样本，包括来自16名晚期HER2阳性（HER2+）患者的19个血浆样本，来自16名晚期三阴性乳腺癌（TNBC）患者的17个血浆样本，以及来自1名晚期HR和HER2状态未知患者的血浆样本。
根据ichorCNA工具，246个血浆样本中有178个的肿瘤细胞分数（TF）≥3%，表明其存在肿瘤。在TF≥3%的血浆样本中，检测了514个DNA片段的信号，确定了先前报道的150个DNA标签的得分，旨在预测肿瘤RNA和蛋白质表型。与预期一致，作为一个连续变量，TF被发现与每个样本中CNA片段数量具有很强的相关性。
结果解读
1.基于血浆和组织DNA的特征
在8周（或8周以上）时间范围内，使用血浆ctDNA（经TF调整）检测了150个DNA标签与54例患者肿瘤组织DNA的相关性。在150个DNA标签中，肿瘤和血浆之间的平均相关系数为0.40（范围为0.02至0.66），40个DNA标签（26.7%）的相关系数≥0.50。8周内获得血浆和肿瘤的27例患者中，相关系数≥0.50的DNA标签数为63（42%，8周以上DNA标签数比例为19.3%），包括所有患者中相关系数≥0.50的40个标签中的36个。两个高度相关的DNA标签是UNC_8q_Amplicon和UNC_Scorr_P53_Mutation。以上结果表明，在不同的时间点和DNA测序方法之间，ctDNA和肿瘤DNA特征存在中度关联。
为进一步证明血浆中基于CNA的数据可以用于识别与组织中相似的生物学状态，作者计算了54个配对样本（肿瘤组织与血浆）中基于CNA的514个DNA片段信号的患者内部相关性。结果显示，57%的患者血浆与组织之间存在大于0.50的相关系数；当对29例血浆TF>10%的患者进行评估时，该相关系数增加到83%。上述结果表明，血浆ctDNA能够可靠地从肿瘤组织中捕获CNA信号，尽管ctDNA的数量可能会影响完其预测能力。
2.基于ctDNA的数据与基于组织RNA表达的数据
对血浆中TF≥3%的108例患者，从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织标本中基于PAM50亚型获得了RNA的表达数据。为了进一步探讨ctDNA与RNA表达之间的关联，作者评估了6个基于PAM50 RNA的组织标签与150个基于ctDNA的标签（通过TF调整）的相关性，发现基于ctDNA的标签与已知的生物学特征（基于PAM50亚型分类的生物学特征）呈正相关或负相关。如，基于ctDNA的RB-LOH标签（富集于E2F靶基因，追踪肿瘤增殖率），与基于PAM50 RNA的Basal样、HER2富集和增殖特征呈正相关，而与基于PAM50 RNA的Luminal A特征呈负相关。
3.基于ctDNA的标签和肿瘤组织ER和HER2状态
为了评估基于ctDNA的标签与ER或HER2状态之间的关系，作者在TF≥3%的178个样本中选择了ER和HER2 状态已知的177个样本进行分析。与预期一致，基于ctDNA追踪管腔生物学特征的标签在ER阳性(ER+)乳腺癌患者中富集，基于ctDNA追踪HER2过表达和扩增的标签在HER2阳性（HER2+）乳腺癌患者中显著富集。总之，这些结果表明基于ctDNA的分析可以捕获并预测特定的肿瘤表型特征。
4.转移性HR+/HER2-疾病中的ctDNA信号
为评估每个基于ctDNA的标签与患者预后的相关性，作者分析了124例接受内分泌治疗和CDK4/6抑制剂治疗的晚期HR+/HER2-乳腺癌患者的基线治疗前血浆样本 （CDK-Validation-1队列）（图7a）。在150个基于ctDNA的标签（经TF调整）中，有36个和37个分别与无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）显著相关；有27个与PFS和OS均有明显关联。其中，基于ctDNA追踪RB-LOH高评分的标签被发现是与不良预后和治疗反应相关的顶级生物标志物之一（图7b-c）。由于RB缺失是对CDK4/6抑制剂耐药的已知机制，作者决定关注这个特征，它由224个拷贝数组成。多变量分析显示，RB-LOH标签与PFS和OS相关，与TF、CDK4/6抑制剂的类型、治疗方案、内脏疾病的存在和转移位点的数量无关（图7d）。此外，作者还检测了RB-LOH标签16个特征的平均ctDNA信号（图7e）。最后，作者在接受内分泌治疗和CDK4/6抑制剂治疗的7例晚期HR+/HER2-乳腺癌患者的配对血浆样本中评估了150个基于ctDNA标签(经TF调整)的评分(即基线和疾病进展后的治疗后评分)(图7f)。
5.基于ctDNA对转移性乳腺癌患者分型
为确定150个基于ctDNA的标签（经TF调整）是否可以识别具有临床相关性的乳腺癌亚型，作者对178个TF≥3%血浆样本中的150个标签进行了无监督的分层聚类分析，共确定了四个主要聚类（图8a）。与其他聚类相比，标签PAM50 Luminal A和HER2-enriched在聚类3中存在差异表达(图8b)。作者还评估了4种聚类与CDK4/6联合治疗反应和内分泌治疗敏感性之间的关系（图8c）。接下来，作者评估了4个聚类在CDK-Validation 1和2队列中的预后价值。与聚类1相比，聚类2、3和4的PFS明显较差，聚类3还与更差的OS显著相关（图8d）。
6.组织样本中基于 ctDNA的肿瘤分型
为了探讨将基于血浆ctDNA确定的肿瘤分型应用于基于肿瘤组织DNA分型时的表现，作者使用来自公开数据库的两个数据集（METABRIC、MSK-IMPACT）作为验证队列，将基于ctDNA分型的预测因子（图8a）应用于上述队列，在两个队列中都确定了4个主要聚类，这些聚类显示了跨染色体的DNA信号（图9a-b）。与其他聚类相比，METABRIC队列中的PAM50非管腔亚型和TP53体细胞突变均在聚类3中富集(图9c-d)。最后，在MSKCC队列中，分析了4个主要聚类与乳腺癌患者生存预后的关系(图9e)。
本章小结
作者先前通过对TCGA早期乳腺癌数据集的计算机辅助监督学习分析，已确定了150个基于DNA拷贝数的多特征预测因子。在该最新研究中，作者使用转移性乳腺癌患者的血液样本预测了复杂的肿瘤表型，探索了上述预测因子是否适用于ctDNA液体活检。结果表明，复杂的肿瘤表型性状可以在ctDNA中鉴定，并可能提供临床价值。总而言之，基于ctDNA的多基因标记方法为生物标志物的发现、验证和其在肿瘤学中的应用带来了新的机会。
文献延伸
1.NEJM：ctDNA指导结肠癌化疗
这是第一项基于ctDNA的结肠癌术后辅助治疗随机对照试验，作者发现采用ctDNA水平指导的Ⅱ期结肠癌辅助治疗，即对术后ctDNA阳性患者采取辅助治疗，而对ctDNA阴性患者不采取辅助治疗，与传统临床病理指导的治疗方法相比有着相似的复发预防效果，但能显著减少辅助治疗的应用。Ⅱ期结肠癌患者的术后辅助化疗决策一直是临床上的一大难题，这项研究为Ⅱ期结肠癌患者的术后辅助治疗决策提供了直接依据。该成果在2022年6月发表在《新英格兰医学杂志》（NEJM）上。
2.Nat Med：ctDNA可以预测非小预后并指导靶向治疗
纪念斯隆·凯特林癌症中心（MSKCC）的研究人员在一项大型前瞻性NSCLC国际队列中，验证了ctDNA阳性结果与更低的总生存率（OS）有关，且独立于临床病理特征和肿瘤代谢体积，接受ctDNA测序后匹配的靶向治疗的患者相比未接受的，OS更高。总之，这项研究表明，ctDNA一方面可以作为一个独立的OS预测因素，另一方面还可以指导NSCLC患者的靶向治疗用药，改善患者预后。该成果在2022年11月发表在《自然·医学》（Nature Medicine）杂志。
3.Ann Onc：ctDNA在四种常见癌症中的预后价值：真实世界结果研究
这是一项真实世界研究，样本来自美国多肿瘤队列，覆盖的疾病类型包括转移性去势抵抗前列腺癌（mCRPC）、转移性乳腺癌（mBC）、晚期（IIIB-IV期或进展/复发）非小细胞肺癌（aNSCLC）以及转移性结直肠癌（mCRC），证实了血浆 ctDNA具有预测晚期肿瘤患者生存预后的潜在价值，并指导临床围绕预期的治疗结果进行个体化干预。该成果2022年10月发表在《Annals of Oncology》杂志上。
结语
通过今天的分享，我们可以知道，“滴血验癌”并不是惊天骗局，而是有迹可循。在不久的将来，人们可能不再是谈“癌”色变，通过滴血验癌这种无创方式进行早筛，尽早发现，尽早治疗，彼时，恐怕这种黑科技才能真正称得上是医学奇迹吧！准确点讲，滴血验癌的对应的专业名词应该是“液体活检”，指一种非侵入式的血液测试来监测肿瘤或转移病灶释放到血液中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）和循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）碎片的方法。阅读至此的小伙伴，仅2022年就有多篇关于ctDNA的重磅研究，我们做科研是不是也可以借一借这"东风"呢？
参考文献：
[1] Prat, A., Brasó-Maristany, F., Martínez-Sáez, O. et al. Circulating tumor DNA reveals complex biological features with clinical relevance in metastatic breast cancer. Nat Commun 14, 1157 (2023).
[2] Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J. Clin. Oncol. 27, 1160–1167 (2009).
[3] Tie J, Cohen JD, Lahouel K. et al.Circulating Tumor DNA Analysis Guiding Adjuvant Therapy in Stage II Colon Cancer. N Engl J Med. 2022 Jun 16;386(24):2261-2272.
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