从生信的视角揭示癌症的前世今生:癌前病变篇
今天分享的文章,于2023年3月13日,在Cell Discovery(IF=38)发表,题为“Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma”的研究论文,该研究通过单细胞测序联合空间转录组,揭示了口腔粘膜癌前病变转化为鳞癌过程中的肿瘤细胞发育分化与细胞互作,以及促癌机制。
总之,该研究数据和结果为进一步的OSCC研究和癌症干预的潜在策略的发展提供了参考,为在癌前病变阶段提前干预,为高危人群早期筛查和个性化预防措施的建立提供理论依据,具有重大临床意义!
背景
单细胞RNA测序(scRNA-seq)能够分离细胞亚群,并探索与疾病发展或治疗相关的特定特征和因素,特别是在完全成熟的癌症中。空间转录组学(ST)的最新进展已经能够同时获取空间组织信息和转录组数据,从而在特定组织或疾病发展过程中产生全面的、时空的基因表达视图。该研究在上皮细胞中发现了一组启动相关基因,以及启动相关的成纤维细胞和免疫亚簇,它们的协同作用促进了癌变。
口腔粘膜白斑(OLK),特别是伴有中度至重度不典型增生的口腔白斑病是最常见的癌前病变之一,有助于口腔鳞状细胞癌(OSCC)的发生。然而,癌前病变的细胞组成和空间组织以及这些因素如何促进人类OSCC的发生仍不清楚。
结果
1.正常,OLK和肿瘤的组织scRNA-seq和ST分析
用无监督聚类识别细胞的11个主要簇,并由簇特异性标记基因注释(图1d–1e)。
将细胞类型的比例/丰度用热图展示,及特定细胞类型标记的代表性表达特征(图1g,1h)。
2.上皮细胞高拷贝数变异(CNV)、FRA和mTORC1信号评分与OSCC起始的相关性
将整个上皮细胞根据表达状态再次聚类(图2a)。聚类结果显示,大多数亚簇彼此之间的距离较近(C1),小部分亚簇分散分布(C2), C2中的大部分细胞来自T区(图2a)。
CNV的统计评分显示,DN和T区的上皮细胞CNV逐渐富集(图2b)。在空间特征图的DN和T区域证实了糖酵解、缺氧和DNA错配修复等癌症形成相关的通路的总体丰度趋势(图2c)。
GO分析显示N、DN、T阶段上皮细胞中表达趋势增加的不同表达基因(DEGs),发现OSCC起始过程中EMT、mTORC1、FRA通路逐渐富集(从N、DN到T组)(图2d)。
ST数据的评分显示了FRA和mTORC1通路的相似变化趋势(图2e, 2c)。
CellphoneDB分析显示从DN期到T期,上皮细胞与周围基质细胞频繁的细胞互作,然而在N期却很少(图2f)。
3.识别参与调节OSCC启动过程的相关上皮标记物
通过scRNA-seq鉴定出8个启动相关基因(8个基因集),并使用ST图进行验证,包括:CTSC、FADD、ITGB4、LGALS1、LY6K、PMEPA1、TFAP2A和TGFβI(图2g、2h、2i)。
值得注意的是,TFAP2A编码FRA通路中的转录因子(TF), LY6K编码淋巴细胞抗原,CTSC是半胱氨酸组织蛋白酶家族的成员,LGALS1编码半乳糖凝集素调节细胞-细胞/基质相互作用(图2h)。
通过ST特征图和组织学染色验证了TFAP2A在上皮细胞中随OSCC起始逐渐升高的表达趋势(图2j, 2k)。
在体外OLK类器官中,敲除TFAP2A后,增殖减慢,其他启动相关基因的表达降低(图2l、2m)。这可能反映了TFAP2A在调控OSCC启动中的潜在作用。
虽然TFAP2A和LY6K有望在DN阶段识别或预防早期SCC,但仍需进一步评估其在OSCC起始中的临床价值。
4.成纤维细胞亚簇主导OSCC起始,在空间上更接近上皮细胞
根据作者的数据和先前的研究,成纤维细胞被分为三个主要的亚群:Mesen_CAF、Infla_CAF和cycling_caf25,26(图3a)。
Mesen_CAF亚群具有高度积累的细胞外基质(ECM)基因(ASPN、POSTN和TNC)和间充质促进TF (TWIST2);Mesen_CAF同时富集生长因子,包括非经典WNT通路(APCDD1、PMEPA1和WNT5A)和趋化因子标记物(CCL2和IL1R1);Infla_CAF亚簇富集经典基质细胞衍生因子CXCL12,并表现出激素和代谢相关标记物(IGF1和CFD)的增强表达(图3b); Cycling_CAF居群小,富集MKI67、CDK1和UBE2C基因,这些基因均与细胞增殖有关。
这些亚簇表现出经典CAF标记的强表达:DCN、FAP、PDGFR-α/β、S100A4和VIM27(图3c, 3d)。
ST特征图和相应的标记染色区域大小统计分析显示,在OSCC起始阶段,Mesen_- CAF标记的表达区域丰度比Infla_CAFs增加了3倍以上,并呈逐渐增加的趋势(图3e-3g)。Mesen_CAF广泛分布于上皮区,而Infla_CAF则更多分布于板层区,提示Mesen_CAF参与了上皮细胞的癌变(图3e, 3f)。
在这两个成纤维细胞亚簇中,针对一些癌症形成相关通路使用GO基因集富集,结果显示Mesen_CAF在TGFβ、EMT、血管生成和PI3K-AKT-mTOR通路中富集(图3h)。
CellphoneDB分析推断这些细胞之间的细胞通讯,如CSF1-CSF1R, TNC-a4b1复合物和TGFβ-TGFβR相互作用,可能参与免疫细胞招募和激活,以及促进Mesen_CAF胶原的形成。综上,scRNA-seq和ST数据都揭示了成纤维细胞亚簇在癌变中的作用。
5.免疫细胞亚群及细胞互作分析
通过空间特征图,分析免疫细胞的分布,标记物染色区域定量结果显示,LYZ(髓系细胞标记物)和CD14(单核细胞标记物)比CD4A和CD8两种T细胞标记物更丰富,倾向于具有免疫耐受的“冷肿瘤”(图4a, 4b)。基于HLA-DRs+和CD14 -为特征,鉴定了在髓系簇中的DC细胞,并进一步分类;基于CD68和CD14的高表达鉴定了单核细胞(图4c)。
单核细胞亚簇中的Mono_INHBA和Mono_NLRP3在IL1B和IL6中高度富集,这两种细胞都是促炎症、血管生成和巨噬细胞极化为M2的关键调节因子(图4d);然而,Mono_INHBA亚群表现出高表达的抗炎因子(图4d);Mono_INHBA的混合表型与报道的单核细胞髓源性抑制细胞(M_MDSCs)具有高度相似性。
多重免疫组化(mIHC)染色进一步验证了Mono_INHBA的富集,DN期的细胞分数最高(图4f,4g)。
耗竭的CD8+ T细胞(CD8+ Tex)在DN期对Mono_INHBA的募集至关重要,因为Mono_INHBA在空间上更接近CD8+ Tex,它们通过CSF1-CSF1R相互作用对相互作用最强(图4h)。
CellPhoneDB分析表明,Mono_INHBA通过INHBA-ACVR_1A/ 2a、SPP1-CD44和VEGFA-NRP1/ NRP2配体受体对与CAFs进行通信(图4j)。
在体外,通过将THBS1添加到OLK类器官中来模拟它们的相互作用,结果表明THBS1促进上皮细胞增殖和上述启动相关基因的表达(图4k, 4l)。
所有结果均表明,Mono_- INHBA被招募到DN区域,并通过与整个生态系统的频繁通信“启动”癌症的形成。
6.参与了癌前病变转化为肿瘤期的免疫细胞亚群分析
在T区,Mesen_CAFs在每个个体中一个簇(cluster 2)的比例明显增加(图5a,5b)。
ST特征图和统计数据显示Mesen_CAF特征基因在肿瘤区域稳定富集(图5c),Macro_NRG1和Macro_APOE的比例在每个个体中从DN期到T期都有所增加(图5d, 5e)。
ST数据显示M2-like巨噬细胞和血管生成通路从DN期到T期呈增加趋势,并且与启动相关基因上皮CTSC的表达水平高度相关(图5f,5e)。
通过伪时间和RNA速度分析,预测了从组织驻留样巨噬细胞Macro_SELENOP获取Macro_APOE/NRG1的可能轨迹。ST特征和统计数据证实了OSCC启动过程中TNFRSF4+ Tregs、TNFRSF4表达和占比的增加趋势(、5k、5l),CD8_Tem与TNFRSF4+ Treg从N期到T期,占比逐渐下降,说明它们在OSCC启动过程中参与了免疫耐受(图5i-5j)。
mIHC染色进一步证实了这些免疫细胞参与了DN期到t期转变过程中(图5m)。总之,这项研究揭示了CAF和免疫细胞亚簇在重塑OSCC起始阶段从DN到T阶段的微环境中的关键作用。
7.DN期周围VEGF信号通路的空间调控
在CellphoneDB分析显示上皮分泌的VEGFA自DN期起就与间质细胞上的受体相互作用,VEGFA在N和DN区上皮上层高表达,但从DN到T区无层限制(图6a,6b)。
在病理专家的指导下,根据角化过度和发育不良这两种OLK的相同特征分别在上皮的上层和下层启动,将N和DN区的上皮分为2部分,相互作用分析显示与N和DN区域下层相比,VEGFA信号在上层表现出明显的表达量增强(图6c,6d)。
总的来说,转录组和染色结果表明,VEGFA和TGFβ1信号在OSCC起始中具有重要作用,在DN阶段周围VEGFA具有空间表达调控。
8.确定的免疫亚群在OSCC起始的临床意义
mIHC染色证实,新生的轻度OLK具有轻度TGFβ信号,免疫抑制髓系细胞浸润有限,而中重度不典型增生的OLK中则相反(图7a,7b)。
动物实验再次证实上述结果。在免疫健全的小鼠中建立了4-硝基喹啉-1氧化物(4NQO)诱导的致癌模型,探讨这些已鉴定的细胞亚簇在体内的功能,作者针对其功能进行了抗TGFβ和抗PD-1抗体的干预。分组和归纳方法显示在流程图(图7c)。第20周时,作者发现所有治疗组(抗PD -1/抗TGFβ/抗PD-1+抗TGFβ组)与未治疗组相比,明显表现出较轻的病变,表明这些抗体对OSCC启动的干预作用(图7d,7e,7f)。
以上数据表明,抗PD -1抗体和这些免疫抑制因子抑制剂对OSCC启动的干预治疗的有效性。