大家好呀，今天分享的文章题为在单细胞水平表征肿瘤微环境揭示骨肉瘤中一种新的免疫逃逸机制，文章内容扎实详尽，于今年一月发表在《Bone Research》（IF = 13.362）上，让我们来一起学习一下吧！

一、摘要

免疫微环境广泛参与骨肉瘤（Osteosarcoma（OS））的发生和发展。然而，OS中免疫细胞的景观和动态特征还不清楚。作者通过分析单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，绘制了OS免疫微环境的图谱。结果表明，一群调节性树突状细胞（DC）可能通过募集调节性T细胞来塑造OS免疫抑制微环境。并且主要组织相容性复合体I类（MHC-I）分子在癌细胞中下调。研究结果表明OS中肿瘤免疫原性降低，这可能是肿瘤免疫逃逸的潜在机制。值得注意的是，CD24被确定为一种新的 ” don’t eat me ” 信号，有助于OS细胞的免疫逃避。总之，我们的研究结果提供了对OS免疫状况的见解，提示骨髓靶向免疫治疗可能是治疗OS的一种有前途的方法。

二、结果

1、使用单细胞测序数据分析骨肉瘤肿瘤微环境

在已发表的单细胞数据集（GSE152048）中，有7个原发性肿瘤病变，2个复发性肿瘤病变和2个肺转移灶。本文纳入了scRNA-seq数据，并与来自85例患者的肿瘤组织的大量RNA-seq数据相结合，经过质量控制后（以及消除患者之间的批次效应），鉴定出了8个细胞簇：髓系细胞（LYZ⁺）、淋巴细胞（CD3D⁺）、破骨细胞（ACP5⁺）、内皮细胞（CLDN5⁺）、血管周围样细胞（PVL）（RGS5⁺TAGLN^high）、癌相关成纤维细胞（CAFs）（TAGLN^lowACTA2⁺）和增殖细胞（MKI67⁺）。在髓系细胞群中，注释了巨噬细胞（APOE⁺CD68⁺）、单核细胞（S100A8⁺S100A9⁺）和树突状细胞（HLA-DQA1^highCD14^-）。对于淋巴细胞，我们对CD4 T细胞（IL7R⁺）、CD8 T细胞（CD8A⁺）、调节性T细胞（Tregs）（TNFRSF4⁺）、自然杀伤（NK）细胞（GNLY⁺GZMB⁺）和B细胞（CD79A⁺JCHAIN⁺）进行了分类。此外， PDGFRA⁺CXCL12⁺ CAFs被注释为炎症性CAFs（iCAFs），而肌成纤维细胞样CAFs的特征是ACTA2高表达，PDGFRA^-表达（图1）。

2、肿瘤相关的树突状细胞通过招募调节性T细胞促进肿瘤免疫耐受

在OS中有三个树突状细胞（DC）亚群，包括传统的1类树突状细胞（cDC1s）（XCR1⁺CLEC9A⁺）和传统的2类树突状细胞（cDC2s）（CD1C⁺CLEC10A⁺）。此外，在OS中发现了一簇CD83⁺CCR7⁺LAMP3⁺树突状细胞，可称为成熟调节树突状细胞（mregDc）。为了研究这些mregDCs是否具有肿瘤特异性，作者通过Harmony软件包从正常外周血单核细胞（PBMC）（GSE94820）和两个OS队列（GSE152048和GSE162454）中提取DC细胞，发现mregDCs优先存在于两个独立的OS队列中，但在正常PBMCs中几乎不存在，表明mregDCs可能是肿瘤相关的DC群体。此外，OS骨髓中CD83⁺CCR7⁺LAMP3⁺树突状细胞的数量高于正常骨髓。综上所述，在OS中存在一组肿瘤特异性树突状细胞（图2）。

在对DC进行重新聚类后，使用来自Seurat v3包的功能来计算从PBMC到OS数据集中识别的不同子集的相似性。结果显示mregDC和cDC1亚群之间具有相似性。使用Monocle2对DC群体和mregDCs进行拟时序分析，发现OS中的mregDCs可能起源于cDC1，这与之前研究结果一致。此外，辅抑制剂CD274、LAG3、LGALS9、SIRPA、TIGIT和PDCD1LG2均沿分化轨迹上调。与cDC1s和cDC2s相比，mregDCs表现出”激活”表型，具有更高的迁移能力和免疫调节能力，表明该DC亚群是成熟的调节DC。更重要的是，mregDCs特异性表达CCR7、CCL17、CCL19和CCL22，它们可以招募多种浸润性T细胞。由于目前只包括11例患者，通过计算mregDC和数据库中T细胞之间的相关性，发现mregDCs与调节性T细胞（Tregs）之间有很强的相关性，同时，作者对肿瘤切片染色发现mregDCs和Tregs物理位置也是相近的。为了研究DC亚群的临床作用，通过CIBERSORTx估算OS细胞比例，发现mregDC评分与较差的总生存率相关，Tregs的积累与总体生存率负相关。mregDC与Tregs之间呈正相关，表明mregDCs可能通过在OS 肿瘤免疫微环境（TME）中招募Tregs来促进肿瘤免疫耐受（图3）。

3、癌细胞免疫原性的异质性

拷贝数变异（CNVs）是一种有效的策略来识别更具侵袭性的癌细胞克隆。研究发现，在成软骨细胞OS病变中积累了更多的典型的CNVs，然而，高CNV是否会导致免疫逃逸尚不清楚。本文检测了CNV与OS中免疫应答之间的关系。通过整合基质细胞，估计每个细胞的CNV。结果显示，癌细胞比成纤维细胞积累了更多的CNVs。有趣的是，在基质细胞中观察到一簇低CNV的癌细胞。转录因子和基序分析发现，转录因子（TF）基序包括CEBPB（+）、FOSB（+）、FOSB（+）、SAP30（+）和ATF4（+）在高CNV的癌细胞中显著上调，而IRF3（+）、ETV7（+）、STAT1（+）和IRF7（+）下调，揭示了一种在OS细胞中由TFs驱动的新的调控网络。此外，MSigDB标志基因集的基因本体论（GO）富集分析和基因集变异分析（GSVA）均显示，IFN-γ反应在低CNV的癌细胞中富集。由于MHC-I的转录下调是损害IFN-γ信号通路抗肿瘤作用的最重要因素之一，随后作者在mRNA水平上检测了MHC-I分子的表达，发现CNV水平较高的癌细胞表现出较低水平的MHC-I基因（HLA-A、HLA-B和HLA-E）和B2M基因，这表明这些癌细胞的免疫原性较低。为了进一步研究MHC-I的下调是否在OS中广泛存在，通过免疫组化（immunohistochemistry）染色评估了OS患者切片中MHC-I和B2M的表达。结果显示，具有高级别的OS下调了MHC-I和B2M的表达。基于这些发现，在高级别OS中，干扰素信号通路和MHCI类分子的下调可能导致免疫逃逸（图4）。

4、CD24信号通路调节巨噬细胞介导的OS免疫应答

在多种类型的癌症中，肿瘤微环境（TME）常常使巨噬细胞分化为促肿瘤表型，OS中大多数巨噬细胞为M2表型（表现出抗炎和促肿瘤作用）。然而，驱动免疫耐受的潜在机制尚未完全了解。癌细胞通过高表达抗吞噬表面蛋白，包括CD47和程序性细胞死亡配体1（由CD274编码）来逃避免疫细胞的清除。CD24是一种新的 ” don’t eat me ” 信号，可以抑制Toll样受体介导的炎症和巨噬细胞的吞噬。CD24和CD47的表达强于CD274，表明在OS中是巨噬细胞介导的免疫逃逸而非T细胞介导的免疫逃逸。并发现CD47在几乎所有细胞类型中都高表达，而CD24在OS细胞中优先表达。荧光原位杂交（FISH）显示，CD24在同一患者的OS组织中的mRNA表达高于正常骨髓。此外，发现高CNV癌细胞比低CNV癌细胞和成纤维细胞表达更高的CD24。IHC染色也显示CD24在高级别OS中有更强的表达。这些结果共同说明了CD24是OS中潜在的免疫治疗靶点。

为了研究CD24在OS中通过调节巨噬细胞表型从而调节免疫反应中的作用，用IL-4处理骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）生成M2巨噬细胞，并将这些吞噬细胞较少的巨噬细胞与GFP⁺ K7M2骨肉瘤细胞系共培养36 h。通过活细胞显微镜观察，在K7M2细胞系中对Cd24a的干扰增强了吞噬作用。类似地，基于荧光激活细胞分选（FACS）的测量结果显示，与随机siRNA相比，转染Cd24a siRNA后的吞噬作用显著增加。此外，与Cd24a敲低的癌细胞共培养的BMDMs具有更多的炎症表型（图5）。

为了研究下调CD24对吞噬作用的保护是否可以在体内重现，作者用胆固醇修饰的Cd24a siRNA或随机siRNA治疗携带骨膜骨肉瘤的小鼠，移植后3周，通过CT扫描检测发现，与随机的siRNA组相比，Cd24a siRNA组的肿瘤致瘤性显著降低。此外，IHC染色显示，Cd24a siRNA组中MHC-II+细胞和浸润的CD4 T细胞显著增加。FACS分析还表明Cd24a siRNA组吞噬作用和抗原呈递作用的增强。总之，我们的研究结果显示，OS细胞通过CD24信号通路逃避巨噬细胞介导的免疫应答（图6）。

5、OS中的细胞互作

通过cellphonedb计算OS中细胞互作为OS TME提供新信息，CD24-SIGLEC10受体对在癌细胞和多个巨噬细胞亚群之间的富集揭示了CD24在OS中的免疫调节作用。此外，SPP1和ITGAV在SPP1⁺ TAMs和CAFs中的超高表达表明，SPP1⁺ TAMs可能通过CAFs中的对齐纤维连接蛋白来促进癌细胞的定向迁移（图7a）。接下来，通过对DC亚群的异质细胞进行相互作用分析发现，cDC1具有通过CXCL10-CXCR3诱导多种T细胞浸润的强大能力，而mregDCs通过CD274-PDCD1和PVR-TIGHT与Tregs的相互作用表现出最高的免疫抑制能力，CAFs和SPP1⁺ TAMs通过ACKR3-CXCL12和CCL2/CXCL1-ACCR1轴与内皮细胞相互作用。ACKR家族在OS中的血管生成中起作用。其他配体受体对通过PGRMC2-CCL4L2参与癌细胞和SPP1⁺ TAMs之间的相互作用，以及通过CXCL12-CXCR4参与CAFs和TAMs之间的相互作用；不同病变例如OS样本有原发性、复发性和转移性病变的成骨细胞骨肉瘤和成软骨细胞骨肉瘤组成，由于细胞不处于同一个TME中，所以细胞不能相互作用；根据不同类型OS中细胞相互作用模式，髓系细胞通过与OS中的免疫细胞和基质细胞的相互作用在TME中发挥作用。

三、小结

OS是一种常见的恶性的肿瘤，对于治疗也是相当困难，TME广泛参与肿瘤的发生发展，本文通过数据库中原有的单细胞数据对OS中细胞进行划分，并发现了确定了一种新的树突状细胞-成熟调节树突状细胞，这种树突状细胞和Tregs高度相关；并且发现CD24是一种新的 ” don’t eat me ” 信号，可以抑制Toll样受体介导的炎症和巨噬细胞吞噬细胞；通过细胞通讯分析发现不同病变类型OS的细胞不能进行细胞互作，这也更加需要个体化治疗。本篇文章的亮点在于利用已有的单细胞数据和RNA-seq数据从新的切入点分析OS的TME中细胞的互作，在发现成熟调节性树突状细胞时，作者比较了在正常PBMC和OS中成熟调节性树突状细胞存在情况，并利用RNA-seq数据计算成熟调节性树突状细胞和个体生存的关系是非常新颖的。

参考文献：Liu W, Hu H, Shao Z, Lv X, Zhang Z, Deng X, Song Q, Han Y, Guo T, Xiong L, Wang B, Zhang Y. Characterizing the tumor microenvironment at the single-cell level reveals a novel immune evasion mechanism in osteosarcoma. Bone Res. 2023 Jan 3;11(1):4. doi: 10.1038/s41413-022-00237-6 . PMID: 36596773 ; PMCID: PMC9810605 .