单细胞测序助力免疫红细胞亚群

导读

众所周知，红细胞是动物体内血细胞中数量最多、作用最强的细胞。它能够携带氧气和二氧化碳，使人体内部碳氧量保持平衡。红细胞被认为是非免疫细胞，非免疫细胞也可以在人体内发挥免疫调节作用。然而，红系细胞在个体发育过程中免疫调节功能的分子和细胞机制仍然不清楚。

背景知识

下文中，作者对来自人卵黄囊、胎肝、早产儿脐血(UCB)、足月脐带血(UCB)和成人骨髓(BM)的红系细胞进行单细胞转录组研究，发现红系前体的经典和免疫亚群具有不同的分化轨迹。在整个人类个体发育过程中，免疫红系细胞从卵黄囊到成年骨髓都存在，但在体外不能从人类胚胎干细胞中产生。与经典红系前体细胞相比，这些免疫红系细胞具有红系和免疫双重调节作用。同时，免疫红系细胞与各种免疫细胞和获得性免疫细胞相互作用更频繁。

结果解读

• scRNA-seq分析确定了一个有免疫倾向红系亚群

作者首先对卵黄囊（YK）、胎肝（FL）和足月新生儿脐带血（UCB）不同发育阶段进行了单细胞转录组测序。然后，作者在每个发育阶段从这些定义的红系簇中提取Gypa表达阳性细胞(Gypa⁺)，用于进一步分析。Gypa⁺细胞主要由红系前体细胞组成，包括前红细胞、嗜碱性红细胞、多染红细胞和正染红细胞，Gypa⁺红系前体的降维和无监督聚类产生了表达红系特异性基因(GypA、HBE1、HBG2和HBB)的四个主要簇(C1-C4) (图1a-c)。为了研究这些簇的生物学相关性，作者用每个簇的特征基因进行了GO富集分析。C1与mRNA分解代谢、翻译启动和RNA剪接有关(图1d，e)；C3具有活跃的细胞周期，核分裂和有丝分裂细胞周期过程显著富集(图1d，e)；C3具有氧气转运和珠蛋白基因表达(图1d，e)，表明C3中的细胞比C1和C2中的细胞成熟。C4独特地富集到了与免疫活性有关的条目，如抗原处理和呈递(例如，HLA-DRA、HLA-E和CD74)(图1e)。RNA速率分析有助于通过区分未剪接和剪接mRNAs来预测单个细胞的发育状态，这表明红系细胞从C1到C3(图1f)逐渐成熟，这与红系成熟评分一致。而C4红系细胞显示出不同的发展轨迹(图1F)，这通过PAGA (partition-based graph abstraction，该轨迹分析可以估计了集群之间的连通性)轨迹分析(图1G)进一步验证。综上所述，对红系前体细胞的scRNA-seq分析可以将有核红系细胞分为经典红细胞簇(C1-C3)和免疫红细胞团簇（C4）。

• YS、FL和UCB红系前体细胞的独特特征

为了研究人类红系细胞在不同发育阶段中的分子变化，作者对来自不同发育阶段的细胞进行了比较分析。如图2a-c，差异表达基因（DEGs）的GO富集分析表明YS、FL和UCB中C1、C2和C3在代谢过程的特征。其中，金属硫蛋白基因MT2A、MT1G和MT1H以及锌转运蛋白基因ZNT(SLC30A)和ZIP(SLC39A)的表达是YS-C3细胞的特征(图2c，d)。基因集富集分析(GSEA)和基因表达动力学证实了与金属离子稳态相关的基因在YS-C3细胞中的高表达(图2e)。此外，YS-C3细胞还富集到了与糖酵解、核糖体生物发生和G2/M期转变相关的基因(图2f-h)。另外，通过比较分析，作者发现循环中的YS红系细胞可能是支持胚胎发育的关键金属转运体，也可能是确保向胚胎提供金属供应的储存库。

• 在hESC衍生的红细胞生成中，缺乏免疫倾向的细胞

人类胚胎干细胞(hESC)向红系分化可用于研究早期胚胎红细胞的生成。为此，作者用白细胞介素3(IL-3)、干细胞因子(SCF)、促红细胞生成素(EPO)和地塞米松诱导人胚胎干细胞向红系分化。在分化第14天，流式细胞仪检测GypA⁺CD71⁺细胞（图3a）。将第4天、第11天和第16天的Gypa⁺红系细胞整合在一起进行分析，并将其划分为三个簇(hESC-C1至hESC-C3)(图3b)。特征基因和GO富集分析表明，hESC-C1细胞与核糖体生物合成相关(如RPL3、RPS2和RPL12)，而hESC-C3细胞与氧运输和气体运输有关(如HBA1、HBA2和HBG2) (图3c，d)。在hESC-C1和hESC-C3细胞中大量表达的特征基因概括了体内C1和C3簇的特征(图3e)。相关分析表明，hESC来源的红系细胞与YS和FL来源的红系细胞关系更密切(图3f)。与YS-C1至YS-C3细胞相比，hESC-C1至hESC-C3之间显示出更高的凋亡率、有丝分裂和铁死亡 (图3g，h)。相反，在YS-C1到YS-C3细胞中表达的基因在一些生物学过程中高度富集，如蛋白质折叠、RNA分解代谢过程和线粒体翻译延长(图3g，h)。总体而言，hESC来源的红系细胞部分概括了体内胚胎红系细胞的特征，但未能表现出免疫特征。

• 免疫红系细胞发挥免疫调节功能

CD71⁺或CD71⁺VISTA⁺有核红系细胞通过细胞间直接相互作用或分泌细胞因子(例如转化生长因子β(TGF-β))来调节免疫反应(图4a)。作者在C4亚群中检测到VSIR(编码VISTA)和TGFB1的高表达，以及IL1B、IL7和TNFSF10等细胞因子基因的表达(图4b)。在C4细胞中，与免疫受体活性相关的基因的表达普遍较低(图4c)，这表明它们产生免疫信号并将其传递给其他细胞。接下来，作者使用单细胞调控网络推理和聚类(SCENIC)来识别经典红系簇(C1-C3)和免疫红系簇(C4)中的主要调节子和基因调控网络(GRN)（图d-e）。为了在实验中捕获免疫红系细胞，作者筛选了在C4细胞中高表达和特异表达的表面标记。CD63在C4细胞中的表达最高(图4f)。流式细胞仪检测显示，Gypa⁺CD71⁺CD63⁺细胞在FL和UCB中分别占2.58%和6.36% (图4G-I)。FL组织切片的免疫组织化学(IHC)染色检测Gypa⁺红系前体细胞CD63的表达(图4J)。作者对分选的FL Gypa⁺CD71⁺CD63⁺细胞进行了scRNA-seq。非监督聚类划分了不同的经典簇和免疫簇(图4k)。免疫簇中的细胞比经典簇中的细胞有更高的免疫反应相关基因的表达，占免疫表型定义的GypA⁺CD71⁺CD63⁺细胞室总数的77.9%(图4 l，m)。因此，免疫红系C4细胞在免疫表型定义的GypA⁺CD71⁺CD63⁺细胞室中高度富集。此外，免疫组化染色检测到FL组织切片中GypA⁺CD63⁺细胞表达免疫标志性蛋白，如HLAE和TNF-β(图4n)。为了深入了解免疫红系前体细胞的功能，分离了UCB-GypA⁺CD71⁺CD63⁺细胞，与外周血单个核细胞(PBMC)共培养，在经LPS处理的GypA⁺CD71⁺CD63⁺-PBMC培养中，促炎症细胞因子的表达增加，包括IL-8、IL-6、肿瘤坏死因子、MIP-1α和MIP-1β(图4o)。将GypA⁺CD71⁺CD63⁺和GypA⁺CD71⁺CD63⁻细胞与CD11b⁺PBMC共培养，细胞内细胞因子染色显示，与GypA⁺CD71⁺CD63⁺细胞共培养后，CD11b⁺细胞中肿瘤坏死因子的表达增加(图4p，q)。综上所述，免疫偏向的红系前体发挥免疫调节功能，参与免疫细胞的炎症反应。

• 免疫红系细胞在成人骨髓中持续存在

为了研究成人骨髓中免疫红系细胞亚群的存在，作者从7名健康人的骨髓中分离出GypA⁺ITGA4⁺SLC4A1^+/−红系前体细胞。ScRNA-seq鉴定了四个转录簇，命名为BM-C1至BM- C4(图5a，b) 。BM-C4中的DEGs和GO富集分析表明潜在的免疫相关功能(图5c)。在BM-C4中高表达的基因主要与白细胞-细胞黏附、淋巴细胞激活和吞噬功能的调节相关(图5c，d)。与经典红系BM-C1至BM-C3簇相比，关键免疫功能基因以及表面标志在BM-C4细胞中高表达(图5e)。在成人骨髓中发现Gypa⁺CD71⁺CD63⁺免疫红系细胞(图5f，g)。细胞内细胞因子染色显示CD11b⁺细胞与BM Gypa⁺CD71⁺CD63⁺细胞共培养后TNF表达增强(图5h，i)。对YS、FL、UCB和BM不同发育阶段免疫红系细胞的比较分析表明，与成人BM相应群体的特征相比，YS、FL和新生儿UCB阶段的免疫红系细胞具有更大的相似性(图5j-k)。总体而言，具有免疫调节功能的免疫前体出现在YS中，并在成年BM中持续存在

• 免疫--红系细胞主动与免疫细胞相互作用

CD71⁺红系细胞的免疫调节作用可以通过直接的细胞-细胞相互作用来介导，但很少有配体-受体对CD71⁺红系细胞与其他免疫细胞类型的相互作用。为了阐明红系免疫细胞免疫调节功能的潜在机制，作者使用CellPhoneDB对免疫红系细胞和其他免疫细胞群体表达的潜在配体-受体对进行了广泛的研究，该工具可以从单细胞转录数据集中预测两种细胞之间的相互作用。总体而言，在所有发育阶段中，免疫红系和免疫细胞之间比经典红系和免疫细胞呈现出更显著地的细胞-细胞间相互作用(图6a)。具体来讲，细胞-细胞相互作用分析证实了免疫红系细胞和巨噬细胞之间的相互作用(图6b、c)。另外，与经典的红系细胞不同，免疫红系细胞不仅与巨噬细胞活跃地相互作用，而且与其他免疫细胞相互作用 (图6d-e)。但在不同发育阶段，作者仅在YS免疫红系细胞和巨噬细胞之间检测到强烈相互作用(图6f)。这些数据表明，免疫红系细胞与各种免疫细胞表现出广泛的、活跃的相互作用，这可能是其免疫调节功能的基础。

全文总结：

该研究构建了人类有核红细胞从胚胎到成年的全面细胞图谱，揭示了人类早期胚胎红细胞独特的分子特征；还成功鉴定和验证了免疫红细胞亚群的存在，开拓了有核红细胞的新功能研究领域，免疫红细胞亚群作为免疫调控网络中的新成员，有望进一步研究它们在各种疾病中的免疫调节作用。

参考文献

1. Xu C, He J, Wang H, et al. Single-cell transcriptomic analysis identifies an immune-prone population in erythroid precursors during human ontogenesis. Nat Immunol. 2022.