破骨细胞(osteoclasts,OCs)源于髓系造血前体细胞,作为多核细胞参与骨吸收过程。OCs的过度分化影响骨组织吸收,常见于骨质疏松症、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、骨硬化症等骨相关性疾病。调控破骨细胞分化是治疗此类疾病的主要方式。OCs分化的途径可以分为核因子受体激活因子-κB配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)介导的主要经典途径如:OPG/RANK/RANKL、TRAF6/RANKL/NF-κB、TRAF6/RANKL/MAPKs、JAK2/STAT3/RANKL、Wnt/RANKL和一些炎性细胞因子(如:IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α)参与的非经典途径。今天给大家分享一篇2022年7月7日发表在Nature Communications(IF:17.694)上,TGFβ重编程巨噬细胞对炎性细胞因子TNF-α反应的相关非经典途径对OCs分化的影响和机制的文章。
TGFβ reprograms TNF stimulation of macrophages towards a non-canonical pathway driving inflammatory osteoclastogenesis
TGFβ重编程TNF对巨噬细胞的作用转变为驱动炎症性破骨细胞的生成
一.研究背景
破骨细胞引起的炎症性骨丢失是许多炎症性疾病的特征,如类风湿性关节炎(RA)、牙周炎和银屑病性关节炎。骨破坏也是炎性关节炎患者发病率和残疾的主要原因。破骨细胞来源于单核/巨噬细胞系,是唯一有效的骨吸收细胞。破骨细胞不仅在生理性骨发育和重塑中发挥着重要作用,而且在直接驱动肌肉骨骼组织损伤和加速以炎性骨溶解为特征的疾病(如RA)的发病机制中发挥着积极作用。核因子κB受体激活因子配体(RANKL)是唯一已知的破骨细胞发生的生理诱导剂。RANKL诱导的破骨细胞生成对于在生理条件下维持正常骨重塑和健康骨量非常重要。RANKL诱导破骨细胞生成的机制已被广泛研究。然而,在炎症条件下驱动破骨细胞生成的机制是复杂的,目前仍知之甚少,尤其是由于肿瘤坏死因子(TNF)等炎性细胞因子很少或没有直接驱动破骨细胞分化的能力。
TNF是一种参与免疫和炎症的关键细胞因子,在许多炎症和自身免疫性疾病的慢性炎症中起着关键作用。TNF激活许多炎症性疾病中的骨侵蚀,例如RA。TNF阻断疗法已证明在抑制关节炎性骨侵蚀方面取得了成功。然而,由于TNF对巨噬细胞或破骨细胞前体只有非常温和的直接破骨作用,并且需要与RANKL协同促进破骨细胞分化,因此TNF如何驱动其对骨吸收的作用是一个长期的谜。
RANK受体阻滞剂和抗RANKL中和抗体最近用于治疗过度骨吸收,通过抑制破骨细胞的形成。然而,这些治疗强烈抑制破骨细胞的形成,并可能导致长期副作用。阻断RANKL信号可导致缺陷和失调的骨重建和骨修复,以及非典型股骨骨折和骨坏死的风险。TNF抑制剂已被用于治疗RA相关炎症和关节侵蚀,但长期使用会产生免疫抑制副作用。此外,炎性骨侵蚀对标准抗吸收治疗具有抵抗力。这表明破骨细胞形成和功能的替代分子途径在炎症条件下可能是活跃的,需要确定此类途径以开发对炎症性疾病有效的抗吸收方法。因此,发现这些介导炎症破骨细胞生成的未知途径和机制是一个重要的医学需求。这些发现可以提供更有效的治疗进展,以抑制炎症性骨丢失,同时消除或最小化生理或疾病环境中对骨重塑或免疫反应的负面影响。目前对这些途径和机制了解甚少。
骨组织中有大量的TGFβ。TGFβ与其受体结合,该受体由TGFβ受体II型(Tgfbr2)和I型(Tgfbr1)组成,并在骨量维持中发挥重要作用。TGFβ是一种多功能细胞因子,经常与其他细胞因子或生长因子相互作用,在不同的细胞和环境中发挥不同的作用。TGFβ和TNF之间的相互作用未被充分研究。
二.研究方法
该工作制备了Tgfbr2条件敲除小鼠,并表明巨噬细胞/破骨细胞前体中TGFβ信号通路的缺失不会影响RANKL诱导的体内外破骨细胞生成。并且发现TGFβ启动使TNF足以启动RANKL非依赖性破骨细胞分化途径。这一发现引入了与经典RANKL/RANK途径不同的破骨细胞生成的第二个分子途径。TGFβ通过为破骨细胞基因表达创造有利的染色质环境,将TNF对巨噬细胞的促炎作用转变为高效的破骨细胞生成功能。在小鼠炎症模型中,阻断TGFβ信号通路可保护小鼠免受TNF诱导的炎症性骨侵蚀。在RA患者的TGFβ水平显著升高,发现从RA患者分离的外周血单核细胞(PBMC)中TGFβ信号通路和破骨细胞基因表达高度富集并相关。TGFβ和TNF介导的破骨细胞生成机制在RA中是活跃的,这表明RA中存在TGFβ和TNF依赖的炎性破骨细胞生成途径。这一先前未被认识的由TGFβ和TNF介导的破骨细胞生成的非典型途径为治疗炎症性骨侵蚀开辟了治疗途径。
三.研究结果
1、TGFβ重编程TNF对巨噬细胞的促炎作用转变为促进破骨细胞的生成
由于RA中TGFβ水平升高,考虑了TGFβ1(TGFβ)是否可能从根本上改变巨噬细胞对TNF的反应,使其足以驱动破骨细胞分化。实验中发现仅以TNF(TGFβ非启动)刺激无法诱导破骨细胞分化(图1a)。用TGFβ和TNF共同处理巨噬细胞可诱导TRAP+细胞,但观察到很少的巨多核细胞(图1a)。但TGFβ在单核细胞分化巨噬细胞阶段(TGFβ启动)能够有效地允许TNF诱导大量巨大的多核破骨细胞(图1a)。在整个单核-巨噬细胞破骨细胞阶段,在培养系统中维持TGFβ也可以使TNF显著诱导大量巨大的多核破骨细胞。并且供体之间TGFβ对TNF的启动效应高度一致(图1b)。破骨细胞生成转录因子FOS和NFATC1以及破骨细胞标记物基因ITGB3、ACP5、CTSK和CALCR的表达通过TGFβ启动显著增强(图1c)。此外,TGFβ启动后产生的TNF介导的破骨细胞具有较强的骨吸收能力(图1d)。TGFβ启动TNF诱导的破骨细胞的细胞核数量、大小和再吸收活性与RANKL诱导的破骨细胞相当。与人类培养系统类似,还发现小鼠骨髓的TGFβ启动显著诱导破骨细胞分化以响应TNF,表明TGFβ启动对TNF的作用在小鼠和人类之间是保守的。此外,这种作用独立于RANKL,过量的OPG不会影响TGFβ对TNF介导的破骨细胞生成的启动效应(图1e)。此外,TGFβ启动不影响RANKL诱导的破骨细胞生成。并且发现TGFβ启动几乎完全消除了巨噬细胞的吞噬功能(图1f)。TGFβ启动还强烈抑制TNF刺激的巨噬细胞中细胞因子IL-1B和IL-6的表达(图1g)。这些结果共同表明,TGFβ启动抑制TNF的炎症作用,促进巨噬细胞产生破骨细胞的反应(图1h)。
2. TGFβ信号的缺乏阻断TNF效应,但不能阻止破骨细胞的生成和骨吸收
接下来,发现Tgfbr2敲除(KO)小鼠(Tgfbr2ΔM)BMMs中的TGFβ信号缺陷不影响RANKL诱导的破骨细胞分化(图2a)。与RANKL诱导的体外破骨细胞分化一致,与WT对照相比,Tgfbr2ΔM小鼠的股骨小梁和皮质骨以及椎体小梁骨的骨表型没有出现明显缺陷(图2b、c)。这些数据表明,在生理环境中,TGFβ信号在破骨细胞分化过程中起着不可或缺的作用。进一步考虑了Tgfbr2的缺乏是否影响破骨细胞生成和骨吸收。在TGFβ启动条件下,TNF未能在Tgfbr2ΔM组中诱导破骨细胞分化(图2d,e)。为了在体内测试TGFβ对TNF反应的影响,通过TNF的炎症反应建立了小鼠颅骨骨溶解模型。PBS注射用作阴性对照,在颅骨表面未观察到吸收坑形成,髓系细胞Tgfbr2缺乏不影响基底破骨细胞的生成(图2f,g,h)。Tgfbr2ΔM小鼠中的Tgfbr2缺乏可显著防止TNF诱导的侵蚀(图2f),并且与WT对照组相比,显著减少了颅骨组织切片上破骨细胞的形成(图2g,h)。随后,探讨了TGFβ启动在炎症性关节炎模型中的作用,选择K/BxN血清诱导的关节炎模型,该模型类似于RA,因此已广泛用于研究由炎性细胞因子(包括TNF)引起的关节周围骨侵蚀。与模拟TGFβ启动条件的WT对照小鼠相比,Tgfbr2ΔM小鼠中基础TGFβ信号传导(非启动)的缺失导致k/BxN关节炎模型中跗骨关节周围骨侵蚀的显著抑制,破骨细胞数量和吸收部位表面的减少(图2i-k)。综上所述,这些结果表明内源性TGFβ信号传导不影响RANKL诱导的破骨细胞形成,但在促进TNF介导的破骨细胞生成和加剧炎症性骨吸收中起着关键作用。
3. TGFβ启动抑制IFN刺激基因(ISG)的表达,促进破骨细胞生成基因表达
接下来研究了TGFβ启动重编程巨噬细胞对TNF的反应以促进破骨细胞生成的机制。通路分析显示参与IFN的基因高度上调,特别是I型IFN信号通路,以及TNF刺激巨噬细胞的炎症反应(非启动条件,图3a)。然而,TGFβ启动富集了核糖体蛋白质和破骨细胞分化通路(图3b)。IFN刺激基因(ISG),包括I型IFN反应基因(图3c)和趋化因子基因(图3d),在刺激24小时后仅由TNF诱导。但在TGFβ启动条件下,TNF没有诱导这些炎症基因,而是激活了许多经典破骨细胞基因(OC基因),包括早期破骨细胞生成调节因子,如FOS、NFATC1和MITF(d1,图3e),以及晚期破骨细胞标记基因,如ACP5、CTSK、ITGB3,OSCAR和CALCR(d6,图3e)。基因集富集分析(GSEA)也证实,I型干扰素反应基因和趋化因子基因在TGFβ非启动条件下显著富集,而TGFβ启动条件下显著富集破骨细胞基因集(图3f–h)。并且进一步证实I型干扰素反应基因的表达,如IFIT1、IFIT2、MX1和STAT1(图3i),以及趋化因子基因,如CCL5、CXCL9和CXCL10(图3j),这些基因在24小时时由TNF诱导,但几乎被TGFβ启动完全消除。
4. TGFβ启动重塑染色质可及性和组蛋白修饰
通过ATAC-seq分析,发现TNF在TGFβ非启动和启动条件下显著诱导差异可及区域(图4a),表明TGFβ启动在很大程度上改变了染色质可及性。对这些差异可及区域相关的基因通路分析表明,TGFβ启动增加了TGFβ信号转导和破骨细胞分化通路的基因染色质可及性(图4b)。将在TGFβ启动条件下被TNF增强表达的DEG称为TGFβ启动基因,包括TGFβ通路基因和OC基因。在非启动条件下,TNF增强的DEG被称为非启动基因,包括ISG。随后发现,与1975个峰值相关的60%的非启动基因位点(745个基因)在TNF刺激下表现出染色质可及性增加(图4c,d),而TGFβ启动显著降低了这些位点在基线/TNF刺激后的染色质可及性,例如MX1、MX2、IFIT2、IFIT3、CXCL9、CXCL10和CXCL11的位点(图4c,d,m)。相反,无论TNF处理如何,TGFβ启动增加了TGFβ启动基因位点处的染色质可及性,例如NFATC1、ACP5、ITGB3和CALCR位点(图4c、d、n)。进一步评估了ISG和OC位点,发现染色质可及性的变化分别与非启动基因和启动基因相似(图4e)。值得注意的是,单独使用TNF不会改变OC基因位点的染色质可及性(图4e,右图),这与单独使用TNF不能有效诱导OC基因表达的结果一致(图3e)。大多数OC基因位点(81%)在TNF刺激前通过TGFβ启动显著打开,尽管在基线检查时未观察到任何基因表达无TNF刺激。这些发现表明,TGFβ启动制备并使这些基因位点能够通过随后的刺激信号进行基因诱导。随着TGFβ启动,TNF刺激进一步增加了一些OC基因位点(图4e,右图)的染色质可及性,例如CALCR位点。
接下来,对与转录激活相关的H3K4me3组蛋白修饰和与转录抑制相关的H3K27me3组蛋白修饰进行分析。在基线和TNF刺激后,在大多数非启动基因(包括ISG)的转录起始位点(TSS)周围发现了H3K4me3信号(图4f,g,m)。这些H3K4me3信号通过TGFβ启动显著减弱(图4f,g,m)。启动基因处H3K4me3标记的基础和TNF刺激水平均较低,但TGFβ启动显著增加了这些基因位点的H3K4me3信号,包括OC基因NFATC1、FOS、ACP5、ITGB3和CALCR(图4f、g、n)。在ISG位点几乎检测不到H3K27me3标记。相反,大多数OC基因(69%),包括NFATC1、ITGB3和CALCR,表现出基础H3K27me3标记,该标记通过TGFβ启动而显著减弱(图4h、i、n)。随后进一步对H3K27ac组蛋白修饰进行分析,该修饰与活性基因转录相关。在非启动基因位点,包括ISG,H3K27ac信号在基线时出现,并在TNF刺激后增加(图4j-m)。这些H3K27ac信号通过TGFβ启动显著减弱(图4j-m)。相反,H3K27ac信号的基础水平和TNF刺激水平在启动基因位点(如OC基因)都较低,但TGFβ启动显著提高了这些H3K27ac信号,TNF刺激的水平更高(图4j-n)。这些H3K27ac信号变化与ISGs和OC基因的H3K4me3标记和转录组学变化一致。总之,大多数OC基因位点在很大程度上是封闭的,巨噬细胞中H3K4me3/H3K27ac水平较低,H3K27me3标记较高,表明这些基因在巨噬细胞中处于非活性转录状态。虽然TNF信号单独有效地增加ISG位点的染色质可及性,但它无法打开OC基因的位点。然而,TGFβ启动将ISG和OC基因的染色质状态切换到相反的方向,从而在基础水平上启动这一过程。通过TGFβ启动,染色质变得闭合,ISG位点的H3K4me3/H3K27ac信号减少。另一方面,TGFβ启动显著增加染色质可及性和H3K4me3/H3K27ac信号,同时减少OC基因位点上的抑制性H3K27me3标记。
5. TGFβ启动抑制TNF诱导的IRF1-IFNβ信号轴
接下来,研究了哪些转录因子可能与染色质重塑协调作用以调节TGFβ启动的基因表达。进行motif分析表明,非启动基因显著富集的转录因子结合位点包括ISRE(IRF)、AP-1、NF-κB和IRF1(图5a)。这些转录因子驱动ISG和炎症基因的表达,以响应TNF刺激(图3)。TGFβ启动富集启动基因的转录因子结合位点,包括FOS、E2F、SMAD2/3/4、MYBL2和MITF(图5a)。FOS、E2F和MITF是重要的破骨细胞生成调节因子。由于TNF通过内源性IFNβ生成诱导ISG表达,接下来研究了TGFβ启动对IFNβ表达的影响。TGFβ启动显著降低了IFNB1染色质可及性和H3K4me3/H3K27ac的水平(图5b)。因此,TGFβ启动几乎完全消除了TNF诱导的IFNB1基因表达(图5c)和蛋白质产生(图5d)。另一方面,TGFβ信号的缺乏促进了TNF诱导的IFNβ产生(图5e),这为TGFβ启动对IFNβ表达的抑制作用提供了补充证据。据文献报道,TNF主要通过IRF1诱导IFNβ表达。随后发现,TGFβ启动使得IRF1位点染色质可及性和H3K4me3/H3K27ac信号显著降低(图5f),这与IFNB1位点的变化一致。并且TGFβ启动的确显著抑制TNF诱导的IRF1 mRNA(图5g)和蛋白质表达(图5h)。干扰素β是一种公认的破骨细胞分化抑制剂。因此,TGFβ诱导的IFNβ减少被认为有助于增强破骨细胞的生成。另一方面,与TNF强烈诱导IRF1相反,RANKL不诱导IRF1表达(图5i),这可以解释IRF1缺乏不影响RANKL诱导的破骨细胞生成的表型。然而,缺乏IRF1显著增强TNF-TGFβ启动条件下介导的破骨细胞分化(图5j)和破骨细胞基因表达(图5k)。TGFβ启动抑制ISG诱导,例如Ifit1、Ifit2、Mx1和Stat1的诱导,被IRF1缺乏进一步显著抑制(图5l)。这些结果共同表明,TGFβ启动抑制TNF诱导的IRF1-IFNβ信号轴,从而有助于ISG基因抑制和破骨细胞促进。
6. TGFβ启动促进IRF8蛋白降解
IRF8是一种有效的破骨细胞分化的抑制性转录因子。IRF8表达下调是破骨细胞发生的先决条件。TNF本身并没有显著降低IRF8蛋白水平,但TGFβ启动使TNF能够快速且实质性地下调IRF8蛋白(图6a)。有趣的是,TGFβ启动并不影响TNF降低IRF8 mRNA水平(图6b)。这表明TGFβ启动调节IRF8蛋白表达的独特机制。使用MG132阻断蛋白酶体活性,并观察到在TGFβ启动条件下IRF8蛋白水平完全恢复到与未启动的水平相似的水平(图6c)。这些结果表明,TGFβ引发降低IRF8的蛋白质稳定性并促进其降解,当蛋白质合成受阻时也是如此(图6d)。与此一致,当蛋白酶体活性被抑制时,在TGFβ启动条件下IRF8的泛素化显著增加(图6e),表明IRF8蛋白降解在很大程度上由TGFβ启动促进。
7. TGFβ启动使TNF能够诱导不同于RANKL诱导的破骨细胞生成调节因子
如图7a所示,TGFβ启动/TNF和RANKL诱导基因中存在许多重叠基因。对这些重叠基因的进一步通路富集分析显示,包括破骨细胞分化和黏附等通路,这是典型的RANKL诱导破骨细胞生成路径(图7a)。与此相一致的是,常见的破骨细胞生成转录因子,如PU.1、NFATC1、FOS、PRDM1、E2F1和MITF,以及破骨细胞标记基因,如CTSK、ACP5、ITGB3和CALCR,均在重叠基因集中发现(图7b)。进一步对与TGFβ启动/TNF诱导的OC基因相关的motif进行分析,发现常见破骨细胞生成转录因子 E2F1,PRDM1,NFATC1,FOS,PU.1和MITF的结合位点富集(图7c)。有趣的是,发现MYBL2(编码B-Myb)的转录因子结合位点异常丰富(图7c),这是在TGFβ启动条件下由TNF诱导的高表达差异基因,而不是由RANKL诱导的(图7b)。B-Myb在破骨细胞分化中的作用尚不清楚。MYBL2位点的染色质可及性在基线时非常低,具有高抑制性H3K27me3标记。TGFβ启动显著打开MYBL2启动子和增强子区域的染色质,降低H3K27me3标记,增强H3K4me3/H3K27ac信号(图7d)。因此,MYBL2是典型的TGFβ启动基因。这些染色质重塑和组蛋白修饰变化一致,MYBL2在基础水平的表达较低,TGFβ启动显著升高TNF诱导的MYBL2表达(图7e,f)。为了检测B-Myb在破骨细胞分化中的功能,下调了其表达(图7g),并发现在TGFβ启动条件下TNF诱导的破骨细胞分化被MYBL2缺陷显著抑制,这可以通过破骨细胞形成减少(图7h)和破骨细胞标记基因表达减弱(图7i)来证明。但是,RANKL不诱导MYBL2表达(图7b,j),因此,RANKL诱导的破骨细胞生成不受MYBL2丢失的影响(图7k)。与发现MYBL2是TGFβ启动基因一致,MYBL2缺乏不会影响TNF诱导的ISG表达,如IFIT1、IFIT2和MX1(图7l)。在TNF诱导的活体颅骨上骨溶解模型的破骨细胞中鉴定出B-Myb的表达(图7m)。进一步制备了髓系特异性Mybl2条件性KO小鼠(Mybl2ΔM),并在体内研究了髓系细胞特异性Mybl2敲除对TNF诱导的炎性破骨细胞生成和骨吸收的影响。与野生型对照小鼠相比,Mybl2缺乏显著抑制TNF诱导的颅骨侵蚀(图7n),并显著减少Mybl2ΔM小鼠颅骨中破骨细胞的形成(图7o,p,TNF组)。在生理条件下,髓系细胞特异性Mybl2缺失不影响破骨细胞的形成(图7o,p,PBS组)。因此,B-Myb是一种未知的破骨细胞生成调节因子,在TGFβ启动条件下特异性促进TNF介导的破骨细胞生成,但不是RANKL诱导的破骨细胞生成。
尽管RANKL和TGFβ启动/TNF共享一些常见的破骨细胞生成转录因子,但仍然存在B-Myb等调节因子,它们在TGFβ启动/TNF介导的炎性破骨细胞分化中发挥选择性作用。这些结果暗示B-Myb可能是炎症破骨细胞形成和骨吸收的特异性治疗靶点。
8. TGFβ表达与RA破骨细胞基因表达高度相关
破骨细胞引起的过度骨侵蚀是与骨溶解相关的疾病(如RA)的一个关键特征。
进一步获得为了深入了解TGFβ在炎症性骨侵蚀相关疾病中的意义,利用最近发布的数据集分析了基因表达谱,包括82名系统性红斑狼疮患者(SLE)和84名类风湿关节炎患者(RA)。虽然类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮有许多共同的症状,但它们是不同的风湿性疾病。一个重要的特征是RA患者经常发生关节糜烂,伴有破坏性破骨细胞的形成/活动,而SLE关节病通常没有进展。此外,I型干扰素信号在SLE患者中很常见,最近的文献表明SLE患者血清TGFβ水平降低。因此,在这项已发表的研究中,来自SLE和RA队列的基因集似乎最适合研究和比较I型干扰素、TGFβ水平和患者破骨细胞性骨侵蚀之间的相关性。RA和SLE中DEG的通路分析揭示了不同的相关通路(图8a-c)。SLE中富集程度最高的通路是IFN I型信号通路,其次是TNF信号通路(图8b)。相反,与RA最显著相关的途径是TGFβ信号传导(图8c)。基因表达热图(图8d)和GSEA分析(图8e)进一步证实了ISG(I型干扰素反应基因和趋化因子基因)在SLE中的显著富集,以及TGFβ信号通路中的基因在RA中的富集。重要的是,这些分析显示RA PBMC中的OC基因高度显著富集,而SLE中的OC基因则不明显(图8d,e)。此外,计算了每个患者中三个典型破骨细胞基因NFATC1、CTSK和ITGB3的平均表达水平,并使用该值来反映单个破骨细胞的活性。为了表明每个患者中TGFβ信号通路的活性,计算了TGFβ及其受体TGFBR1和TGFBR2的表达平均值。然后发现,每位患者的TGFβ活性与破骨细胞活性呈正相关,并且RA队列中的TGFβ活性和破骨细胞活性均远高于SLE队列(图8f)。此外, RA患者中TGFB1、FOXM1和MYBL2的mRNA表达水平显著高于SLE患者(图8g)。相反,与SLE患者相比,RA中IFNB1、IRF1和IRF8的表达水平降低(图8g)。总之,这些患者结果进一步支持了TGFβ信号传导与ISG和OC基因差异表达之间相关性的医学相关性,并强调了TGFβ信号传导在疾病环境中抑制炎症和促进破骨细胞生成的生物学意义。
四、总结
总之,该研究工作发现TGFβ通过重塑染色质和组蛋白修饰与特定转录因子协同作用,重新编程巨噬细胞对TNF的反应,并将细胞命运转移到破骨细胞生成。这些发现确定了TGFβ在调节TNF对巨噬细胞极化/分化的作用和RANKL非依赖破骨细胞分化途径中先前未被认识的功能。在TGFβ和TNF介导的炎性破骨细胞生成程序中发现的这些机制暗示了选择性抑制炎性骨吸收的治疗策略,而不会对生理性骨重塑产生显著影响。