今天给大家分享一篇2023年2月7日发表在Nature Communications （IF:17.694）上，通过单细胞和空间转录组的整合分析解析前列腺癌免疫抑制性的肿瘤微环境的文章。

Dissecting the immune suppressive human prostate tumor microenvironment via integrated single-cell and spatial transcriptomic analyses

一．研究背景以及研究方法

前列腺癌（PCa）是一种临床异质性疾病。低风险原发性前列腺癌的治疗只需要积极监测，而高风险疾病则需要多模式治疗，包括手术、放射治疗和激素治疗。转移性疾病的复发和发展仍然是一个临床问题，对免疫逃逸和肿瘤进展的驱动因素尚不清楚。在这里，研究者综合描述了前列腺癌的肿瘤微环境（TME），并与癌旁组织样本和健康对照进行了比较。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和高分辨率空间转录组相结合分析肿瘤背景相关的基因表达变化。经研究，作者发现免疫抑制性肿瘤微环境与抑制性髓系细胞和耗竭T细胞以及高基质血管生成活性有关。

二．研究结果

1、前列腺癌TME的单细胞和空间转录组图谱

从19名诊断为前列腺腺癌并接受根治性前列腺切除术的未接受治疗的患者中采集新鲜前列腺癌样本。在19名患者中的15名患者中，对肿瘤附近匹配的“正常”良性前列腺组织进行了采样。作为对照，从5名患者的健康前列腺组织（图1a）。共计得到179359个单细胞，并基于细胞类型特异性基因注释细胞类型，形成16个主要簇（图1b，1c）。由于作者旨在关注前列腺免疫TME，他们的分离方案被优化以富集免疫细胞（图1d）。就主要细胞群的丰度而言，当将肿瘤与癌旁进行比较时，在浆细胞、巨噬细胞和内皮细胞中观察到显著但微小的差异（图1e）。他们使用加权表达距离检查样本之间转录状态的总体相似性，发现显示与正常和健康组分相比，肿瘤组分之间患者间变异性显著增加（图1f）。这表明不同患者肿瘤区域的细胞状态轨迹不同。

为了从空间层面验证单细胞发现，作者使用Slide-seqV2进行了空间转录组学。从两个健康前列腺样本和两个前列腺肿瘤样本（一个LG Gleason评分和一个HG Gleason得分）及其相应的相邻正常组织中采集新鲜冷冻10微米切片（图1g）。基于scRNA-seq参考数据，使用RCTD算法对Slide-seqV2空间转录组数据进行反卷积。正如预期，与scRNA-seq数据相比，Slide-seqV2测量结果显示细胞比例的差异更为显著，上皮细胞和成纤维细胞数量大大增加，免疫细胞比例显著减少（图1d）。

通过Slide-seqV2观察到的细胞结构组成与标准H&E染色的预期一致。健康前列腺组织的高度详细的空间结构显示，组织良好的前列腺上皮腺体被免疫和非免疫基质细胞包围，包括成纤维细胞、周细胞和内皮细胞（图1g，图1）。这种结构在前列腺癌中被明显破坏（图1g，图3和图4）。组织组织的差异通过使用Moran I评分的空间自相关来量化，该评分评估细胞聚集（高分）或分散（低分）的程度。与健康组织相比，肿瘤中的成纤维细胞、内皮细胞和周细胞Moran I评分显著减少（图1h）。

2. 前列腺癌基因Signature区分正常和恶性上皮细胞

根据无监督聚类，得到了四种上皮亚群：Basal、Luminal、Club和Hillock（图2a）。随后，作者使用RNA Velocity推断上皮细胞的分化轨迹。一个轨迹表明，Club充当Luminal的祖细胞。第二个轨迹表明Hillock可能充当Luminal的祖细胞（图2b）。作者使用InferCNV分析，从肿瘤内的正常管腔细胞中分离出恶性Luminal细胞（具有大片段拷贝数变异）。差异表达基因（DEG）分析用于识别恶性细胞的表达特征，得到由八个基因组成的gene signature（图2c）。鉴于上皮间质转化（EMT）在前列腺癌的进展和转移中起着重要作用。与来自三种不同样本类型（健康、癌旁和肿瘤）的非恶性管腔上皮细胞相比，恶性细胞显示出显著更高的EMT基因特征（图2d）。

在空间上，健康前列腺组织显示出有组织的腺上皮，具有良好结构的基底细胞和管腔细胞双层（图2e）。癌旁样本随着管腔上皮群体的扩大和组织良好的腺体的丢失而不同（图2e）。使用RCTD反卷积上皮亚群，并使用四种不同上皮亚群的关键标记基因进行验证（图2e，2f）。如空间自相关所示，在健康前列腺组织中观察到的Club和Hillock细胞在肿瘤和邻近正常组织中被破坏（图2e）。将由单细胞数据中获得的前列腺癌gene signature用于评估Slide-seqV2数据中的肿瘤细胞注释。该8个基因成功地识别了HG病例中的肿瘤富集区域（图2g）。在健康和癌旁样本中几乎没有肿瘤细胞被注释（图2g），这证明了“前列腺肿瘤基因特征”的准确性。

3. 前列腺肿瘤微环境表现出高内皮血管生成活性

作者共鉴定了五个基质亚群，包括两个内皮细胞、两个周细胞和一个成纤维细胞亚群（图3a）。Endothelial-1亚群表现SELE/SELP/CLU/PLVAP基因的高表达，而Endothelial-2亚群则表现出共同的动脉基因（HEY1/IGFBP3/FBLN5）上调。GO通路分析表明Endothelial-2参与血管发育和血管生成的途径（图3b）。并且，与其他基质群体相比，肿瘤内的Endothelial-2的血管生成得分最高（图3c）。在Slide-seqV2空间转录组中比较了“肿瘤”和“肿瘤邻近”环境中的Endothelial-2的转录组变化（图3d）。空间转录组中Endothelial-2的通路富集分析与单细胞数据一致，显示血管生成和血管内皮生长因子通路的上调（图3e）。并且与正常和健康样本的组织良好的结构相对比，发现肿瘤中该亚群处于一种特别分散的状态（图3f，3g）。

此外，作者还鉴定了两个周细胞亚群（图3a）。Pericyte-1中富集细胞外结构组织和结缔组织发育的通路，而Pericyte-2则与血管平滑肌细胞一致的肌肉收缩相关通路（图3b）。此外，与健康前列腺相比，癌旁组织样本中的两种周细胞亚群的血管生成评分显著增加（图3c）。在空间上，与健康和相邻正常样本相比，Pericyte-1细胞分散在肿瘤样本中（图3f，3g）。总之，这些数据表明周细胞在前列腺癌进展过程中在血管生成和肿瘤间质重塑中的作用。

4. 肿瘤微环境中肿瘤细胞与间质细胞的相互作用

作者利用Slide-seqV2空间转录组来探索肿瘤内细胞之间的潜在互作（图4a）。分析发现肿瘤细胞与间质细胞之间具有405个显著的配体-受体相互作用（图4b）。随后，他们研究了将肿瘤细胞作为配体来源和基质细胞作为表达受体时（图4c），肿瘤细胞表达血管内皮生长因子（VEGFA和VEGFB），可通过VEGF受体、FLT143和β-1整合素刺激Endothelial-2。这些现象可能解释肿瘤相关Endothelial-2亚群状态中促血管生成的变化（图3e）。他们还观察到肿瘤细胞和成纤维细胞（COL9A2-ITGA1）以及肿瘤细胞和Pericyte-2细胞（COL12A1-ITGA1）之间的潜在相互作用，这两种通路都参与细胞外基质重塑和细胞迁移（图4c）。反向相互作用（即，基质细胞表达肿瘤受体配体）的分析揭示了成纤维细胞胰岛素样生长因子（IGF1）刺激肿瘤细胞IGF1受体介导的潜在相互作用（图4d）。已知IGF途径通过抑制细胞凋亡和激活细胞周期促进肿瘤生长和存活。IGF1-IGF1R相互作用的Slide-seqV2分析证实了表达IGF1R的肿瘤细胞和表达IGF1的成纤维细胞的共定位（图4e）。

5. 前列腺癌中富含免疫抑制性髓系细胞

对髓系细胞进行无监督聚类分析，得到了三个单核细胞、三个巨噬细胞和一个髓系DC（mDC）亚群,并且通过单核细胞和巨噬细胞gene signature进行验证（图5a，5b和5c）。单核细胞亚群的特征为CD16hi（CD16hi-Mo），其被称为非经典单核细胞，以及肿瘤炎性单核细胞（TIMo），其具有CD14的高表达（图5b）。第三个亚群被注释为单核细胞巨噬细胞（Mo-MΦ），是一种单核细胞向巨噬细胞的过渡细胞状态。由于PCa患者的免疫抑制性TME与髓系衍生抑制细胞（MDSCs）的积累相关，作者在TIMo细胞亚群中发现MDSC基因签名得分最高（图5c），与健康前列腺组织相比，癌旁与肿瘤中的TIMo细胞的MDSC基因签名显著更高（图5d）。这表明TIMo通过免疫抑制活性在前列腺肿瘤生长中发挥作用。

随后，他们确定了三个巨噬细胞亚群（图5a），包括肿瘤炎性巨噬细胞（TIMΦ）具有比较高的“炎症基因签名”、抗原呈递巨噬细胞（AP MΦ）具有比较高的“抗原处理和呈递基因签名”，以及M2巨噬细胞（M2-MΦ）具有比较高的“M2基因签名”（图5c）。M2-MΦ显示出从健康样本到肿瘤样本的细胞丰度逐渐增加（图5e）。

在与单细胞表达相同的组织样本上原位进行的多重免疫组化（mIHC）证实，与匹配的相邻正常组织相比，CD68⁺巨噬细胞和CD68⁺CD163⁺M2MΦ在肿瘤组织中的浸润更高（图5f）。在高Gleason评分（4+4、4+5、5+5）的病例中，M2-MΦ对肿瘤浸润的量化更为明显（图5f）。M2-MΦ表达高水平的参与血管生成的基因，如血管生成因子EGFL757和肿瘤转移如LYVE158和NRP159，表明M2-MΦ浸润在肿瘤内血管生成中的作用。

6. 前列腺癌症的特征是T细胞耗竭和免疫抑制Treg活性

适应性免疫系统在建立针对肿瘤的有效的抗原特异性免疫应答中起着关键作用。根据无监督聚类，将淋巴细胞分为了四个CD4⁺T细胞、三个CD8⁺T细胞和两个NK亚群（图6a，6b）。CD8⁺T细胞的功能状态使用细胞毒性基因特征进行分析。有趣的是，与影响免疫治疗效果的“冷”肿瘤相比，“热”肿瘤中三种不同CTL的T细胞毒性得分显著更高（图6e）。此外，作者发现与健康前列腺组织相比，CTL-1和CD8⁺效应细胞都表现出更高的T细胞耗竭基因信号的表达（图6c），并且肿瘤和癌旁样本中的耗竭分数更高（图6d）。

CD4⁺T细胞被细分为naïve型、Th1型、Th17型和Treg（图6b）。作者发现与邻近正常和健康样本相比，从肿瘤中收集的Treg中的Treg活性得分明显更高（图6f）。值得注意的是，肿瘤坏死因子受体超家族TNFRSF9、TNFRSF18和TNFRSF4的基因在浸润肿瘤的Tregs中高度表达。这些受体结合肿瘤坏死因子、参与炎症相关致癌物和支持免疫抑制TME的促炎细胞因子。

7. 髓系细胞和淋巴细胞间的相互作用

Tregs和MDSC是两个对癌症免疫耐受很重要的免疫抑制细胞群。这两种人群在肿瘤部分中都表现出高抑制活性，并且它们之间的相互作用先前已在不同的癌症中报道过。基于此，作者分析了肿瘤样本及其邻近正常组织中TIMo中MDSC评分和Treg中Treg活性评分之间的相关性，发现在肿瘤组中，MDSC评分和Treg活性评分显著相关，LG和HG Gleason患者之间没有明显区别（图7a）。在相邻的正常组织中没有发现相关性（图7a）。随后检查了两个亚群之间显著的潜在配体-受体相互作用。数据显示CCL20-CCR6分别是TIMo和Tregs之间相互作用的重要信号轴之一（图7b）。CCL20在TIMo中高度表达，其同源受体CCR6主要在Treg、Th1和Th17中表达（图7c，图7d）。几项研究表明，CCL20信号通过招募Treg和/或Th17，在增强肿瘤生长、侵袭性和化疗耐药性方面发挥作用。

为了验证CCL20-CCR6轴是否参与PCa的免疫抑制性TME，作者将RM1-PCa细胞系皮下注射到C57BL/6J野生型（WT）小鼠中。当肿瘤体积达到300-400mm³时，用CCL20阻断抗体单独或与免疫检查点阻断（抗PD-1）联合治疗小鼠。使用CCL20阻断抗体阻断CCL20-CCR6相互作用显著降低了RM1肿瘤生长，对抗PD-1没有组合效应（图7e），表明CCL20-CRR6轴参与前列腺癌免疫抑制性TME。

四、总结

总的来说，这个对原发性前列腺肿瘤样本及其正常对照进行单细胞和空间转录组的整合分析为了前列腺癌研究人员提供了丰富的数据资源。通过实验验证肿瘤与癌旁免疫细胞和基质细胞的关系，将有助于更好地了解前列腺癌的进展，并将为这种常见疾病确定新的治疗靶点。目前，这种将单细胞与空间转录组结合分析出机制，然后用湿实验验证的方式已经成为单细胞相关文章主流方向！心动的话，赶快行动起来吧！