导读

据2020年全球癌症统计数据，胃癌（GC）已经成为最常见的癌症类型之一，是全球范围内第四大癌症相关死亡原因。晚期胃癌患者预后不良，中位生存期短于1年。因此，还需要开发新型药物来延长胃癌患者的总生存期。尽管免疫治疗是大部分胃癌患者的首选，但是胃癌异质性阻碍了开发新型药物的脚步。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）广泛用于研究各种癌症类型肿瘤内和肿瘤见异质性并揭示了炎症，癌前病变和胃癌的单细胞特征。scRNA-seq可以用于分析异质和功能亚群，对胃癌的异质性研究提供重要价值。下面，小编就为大家介绍几篇近年来应用scRNA-seq数据研究胃癌的文章。

案例一：单细胞测序研究胃癌患者的成纤维细胞

肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）的活性可以作为治疗癌症的潜在治疗靶点。然而，胃癌中CAF的异质性尚不清楚。这篇文章作者通过对8例GC样本和邻近黏膜（AM）样本进行scRNA-seq。分析CAF亚群的特征及其CAF亚群调控的肿瘤微环境（TME）组分之间的动态通讯。

scRNA-seq揭示癌症相关成纤维细胞亚群与胃癌患者的不良临床结局

作者对8例胃癌样本和邻近黏膜样本进行scRNA-seq，共获得36897个细胞，聚为23个细胞簇，注释为7类细胞，分别为上皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞，T细胞，B细胞，巨噬细胞和肥大细胞。

肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）具有促进肿瘤进展的多种作用，是肿瘤微环境的重要组分。基于特异性细胞标志物的表达，作者鉴定到4个成纤维细胞亚群，分别为及纤维母细胞，周细胞，细胞外基质CAFs（eCAFs）和免疫调节CAFs（iCAFs）。对4个CAFs亚群的差异分析和富集分析表明4个CAFs亚群具有不同的作用。其中，肌成纤维细胞中高表达基因富集于肌肉收缩，血管平滑肌细胞增殖和血管发育。周细胞中上调基因富集于血管发育。肿瘤来源的iCAFs上调基因与炎症反应的调节有关。说明这些细胞在与免疫细胞交流中发挥作用。此外，作者发现了一类以POSTN高表达为特征的CAF亚群，该基因编码蛋白支持上皮细胞黏附和迁移并促进肿瘤干细胞维持和转移。作者将这类细胞定义为细胞外基质CAFs（eCAFs）。eCAFs中具有肿瘤侵袭相关基因高表达，说明eCAFs是肿瘤转移的TME重要组分。KM分析表明，POSTN高表达的患者总生存期较短。总的来说，eCAFs是CAF的重要亚群，具有促进肿瘤转移和影响患者预后的作用。免疫组化结果表明，iCAFs富集在肿瘤腺体内和淋巴结样结节中，说明他们可能参与调节淋巴细胞。eCAFs分布于远端间质区域。

案例二：单细胞测序研究胃癌患者多种细胞亚型异质性

肿瘤微环境（TME）由多种细胞类型和细胞外组分组成，他们围绕在肿瘤细胞周围，由血管网络滋养。TME中的细胞异质性及其复杂，使用scRNAseq可以在单细胞分辨率下研究各种恶性细胞和非转化细胞类型。这篇文章作者使用scRNAseq研究胃癌中免疫抑制微环境和特异性细胞类型间的相互作用，通过对9例非转移性胃癌样本和正常样本进行scRNAseq鉴定TME中不同亚群的免疫细胞和基质细胞的基因表达变化并构建胃癌的细胞相互作用网络。

单细胞景观揭示活性细胞亚型及其在胃癌肿瘤微环境中的相互作用

作者对9例非转移性胃癌样本和正常样本进行scRNAseq，共获得47304个细胞，17个细胞簇注释为7种细胞类型，包括T细胞和NK细胞，B细胞，髓系细胞，肥大细胞，成纤维细，内皮细胞，上皮细胞和恶性细胞。

首先，作者对T细胞和NK细胞进行重聚类共得到14个亚群，主要包括调节性T细胞，CD4+ T细胞，CD8+ T细胞，自然杀伤细胞和先天淋巴细胞。肿瘤样本中Treg的比例高于正常样本，说明Tregs在肿瘤样本中募集。TCGA数据集结果表明Treg的特征基因在肿瘤样本中高表达。肿瘤样本中的Tregs与免疫抑制相关的多个基因高表达。GSVA分析表明IL2-STAT5信号通路，IL6-JAK-STAT3信号通路和PI3L-AKT-MTOR信号通路等在肿瘤样本中上调。以上结果表明胃癌微环境具有免疫抑制作用。

接下来，作者对髓系细胞进行重聚类共获得15个亚群，其中M01-M03为单核细胞，M04-M07为树突状细胞，M08-M11为巨噬细胞，M12,M13和M15为低质量细胞。M04中CD1C，FCER1A和CLEC9A高表达，M05中CLEC9A高表达，M07中LILRA4高表达，M06种LAMP3，CCL22和CCL19高表达。M06亚型中的细胞均来自肿瘤样本，说明LAMP3+ DC亚型在肿瘤样本中富集。TCGA数据集分析表明LAMP3+ DC亚型的特征基因在肿瘤样本中高表达。树状图表明，LAMP3+ DC与cDC1和cDC2簇均到一起。轨迹分析表明，LAMP3+ DC可以来自于胃癌的cDC2和cDC1。SCENIC分析表明，在LMAP3+ DC中，IRF1,IRF2,NFKB1和NFKB2活性上调，说明IRF家族和NF-kB是DC分化和成熟的关键调控因子。

对于巨噬细胞来说，M08中INHBA，PTGS2和促炎细胞因子和趋化因子高表达。M09和M10种C1Q多个基因和抗原提呈基因高表达。M11中多种干扰素诱导基因高表达。M08为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。巨噬细胞可分为促炎M1和抗炎M2类。M08和M11中M1特征基因高表达，M9和M10中M2特征基因高表达。对TAMs和C1QC+巨噬细胞的基因表达水平分析鉴定到49个上调基因。GSVA分析表明TAMs中WNT β catenin信号，血管生成和上皮间质转化活性增加，而C1QC+ 巨噬细胞在MHC Ⅱ类抗原呈递中上调。

3467个成纤维细胞聚为11个细胞亚群。其中F01为周细胞，F01在肿瘤样本中的丰度较高，免疫荧光染色表明周细胞位于血管周围，血管生成因子在F01种表达水平升高，说明F01在胃癌的新生血管中起到关键作用。F03为正常组织中的成纤维细胞亚群，其表达特征与人类结肠间充质细胞S2亚群类似，可能在维持上皮内稳态中发挥作用，然而肿瘤组织中F03亚群较少，说明肿瘤中上皮屏障的功能障碍。F06来源于正常组织，CFD，CLU，COL14A1和PI16高表达，该簇是多种组织中的成纤维细胞亚型。此外，多个补体因子在F06种高表达，说明F06在先天免疫防御中发挥作用。F04，F05和F08富集于肿瘤样本，为癌症相关成纤维细胞。CTHRC1在F04中高表达，CTHRC1与多种肿瘤的进展有关，免疫荧光染色表明CTHRC1+细胞位于肿瘤组织的内皮细胞周围。TCGA数据集分析表明高表达Fib-CTHRC1的特征基因预后较差。F05为COL14A1+成纤维细胞簇，其中C7和APOD高表达，MMP1，MMP3和MMP9在F08种高表达。

1873个内皮细胞聚为9个细胞亚群。其中E01为尖端样细胞，ESM1，KDR和PDGFB高表达。TCGA数据集分析表明E01中的特征基因在胃癌组织中高表达，说明胃癌中血管生成非常活跃。E02和E03种ACKR1和SELP高表达。免疫荧光染色表明ACKR1在肿瘤的ECs中高表达。TCGA数据集中ACKR1高表达患者的预后较差。E04中CD36和CA4高表达，代表毛细血管内皮细胞。E05中多种动脉ECs标志物高表达。E07中多个干扰素诱导基因高表达。E09种LYVE1和CCL21高表达。

最后，作者使用CellPhoneDB2研究细胞-细胞相互作用。正常组织中，髓系细胞的相互作用较多。而在肿瘤组织中，内皮细胞与纤维细胞，单核细胞，巨噬细胞和DC存在相互作用。EC-ESM1与四个成纤维细胞亚群具有较强的相互作用。总的来说，内皮细胞和纤维细胞相互作用的增强是胃癌细胞-细胞相互作用的根本变化。

案例三：单细胞测序研究胃癌不同转移器官的细胞异质性

在胃癌治疗中最困难的问题主要在于手术治疗效果不好和向不同器官转移。淋巴结，肝脏，腹膜，肺，骨和卵巢是常见的靶部位。肿瘤细胞可通过血液，淋巴细胞和腹腔内扩散侵袭远处部位。肿瘤细胞会通过激活特定的基因和通路并向特定器官表现出趋向性，而肿瘤招募的免疫细胞和宿主微环境在促进转移进展中也起着重要作用。因此，器官特异性转移特征的精确定位十分重要。然而，GC向不同器官转移的特征还十分不清楚。这篇文章，作者使用scRNAseq研究胃癌的原发肿瘤和不同器官转移研究癌细胞和TME在肿瘤内和肿瘤间的异质性以及不同器官转移模式。

scRNA-seq揭示人类胃癌器官特异性转移的转录异质性

作者对10例胃癌组织，包括3例原发组织（PT），1例正常组织（NT）和6个转移灶（M）（肝，淋巴结，腹膜，卵巢）进行scRNAseq，共鉴定到42968个基因，包括上皮细胞，基质细胞，增殖细胞，T细胞，B细胞，自然杀伤细胞和髓系细胞。在不同原发组织和转移灶中，细胞比例差异很大。

首先，作者分析上皮细胞。83%的非恶性上皮细胞来自NT，恶性上皮细胞中的肿瘤特异性基因表达水平较高。对PT和M的恶性上皮细胞进行聚类鉴定到4个亚簇。对G0和其他恶性上皮细胞的DEG进行IPA分析，G0细胞表现出肿瘤血管化和侵袭特征。VEGFA在G0细胞中显著上调并在ILK通路和IL-8信号通路中激活。G0细胞可能具有血管生成和侵袭性。G1细胞的特征为迁移和EMT，这些细胞更容易通过腹腔内扩散进行转移。G2细胞主要分布在LN2和PT3中，G2细胞可能是GC中休眠型肿瘤细胞。G3细胞主要分布于PT和M，Li中，G3细胞与GC恶性进展有关。TCGA数据集的KM分析表明，G0，G1和G3相关基因高表达的患者总生存期较差。

接下来，作者分析内皮细胞，共鉴定到3个亚簇。E0的IGFBP5，STC1和IGFBP3在PT和M中而在NT中不表达，其中IGFBP3和STC1影响血管生成发芽。IPA分析表明与肿瘤侵袭GC密切相关的mTOR和IGF-1信号通路在E0细胞中正调控。疾病和生物功能分析表明E0细胞会增加肿瘤细胞的侵袭和迁移，说明E0细胞会促进胃癌侵袭。E1细胞在PT和M中最多，IPA分析表明E1细胞与T细胞衰竭信号通路的调控密切相关。NT中大多数内皮细胞为E2簇，其活性低于其他亚群说明他们是正常的内皮细胞。此外，作者使用TCGA数据集评估E0和E3特征标记对患者生存期的影响，E0基因高表达的患者总生存期较低。

889个成纤维细胞聚为2个亚簇，其中F0是PT和M的原代成纤维细胞，定义为iCAFs，而F1在不同组织中的比例不同，定义为mCAFs。对这两类细胞中的上调DEGs进行GO分析。mCAFs和iCAFs均富集生物功能细胞外基质/结构组织和细胞基质粘附，而mCAFs富集于肌肉相关过程，iCAFs负疚细胞外基质分解，白细胞迁移调节和血管生成的调控。CCI分析表明，配体受体对CXCL12-CXCR4参与了iCAFs与T细胞，B细胞和髓系细胞的相互作用。此外，iCAF标志基因高表达患者的总生存期较差。

案例四：单细胞测序研究胃癌预后相关基因

脂肪酸结合蛋白（FABPs）是一种高度保守的低分子量的细胞质蛋白。FABP1主要溶解脂肪酸，脂肪酸参与细胞内代谢等信号过程。FABP1蛋白具有经典的β结构折叠和α螺旋。FABP1具有多种功能，包括抗氧化应激的保护剂，参与调节脂肪生成和脂质代谢。FABP1与各种疾病有关，FABP1的表达水平与各种肿瘤发生发展密切相关。这篇文章作者对胃癌的scRNAseq数据进行分析，发现FABP1是GC组织中最显著差异表达的基因，是GC发展的核心基因并且与GC患者的预后有关。

胃癌scRNAseq揭示FABP1是一种新的预后生物标志物

作者对GSE134520单细胞转录组数据集进行分析，得到4110个细胞和3385个基因。tSNE分析和注释后鉴定到胃细胞，浆细胞样树突状细胞和记忆T细胞。

随后，作者进行了伪时间分析并对DEGs进行GO和KEGG富集分析。DEGs主要与蛋白靶向，蛋白质定位，中性粒细胞脱粒，细胞-底物链接合细胞黏附分子结合等功能有关。KEGG分析表明DEGs主要与氧化磷酸化，内质网中蛋白质加工和TNF信号通路有关。

使用COMPPI数据库和Cytoscape绘制网络图，并给予差异细胞位置筛选网络中FABP1的靶基因。作者以FABP1为靶点，筛选7个相关蛋白并构建PPI网络。FABP1与激素敏感脂肪酶介导的三酰甘油水解，脂肪消化和吸收显著相关。SurvExpress数据集结果表明，FABP1的表达水平对STAD患者的总生存期显著相关。此外，FABP1表达水平同样与早期病理诊断的年龄相关。

为了进一步研究FABP1在GC组织中的表达及其预后的关系，作者使用IHC分析FABP1在GC组织中的表达情况。结果表明，FABP1在胃癌组织中表达水平较高。KM分析表明，FABP1高表达与预后较差有关。说明，FABP1在胃癌中具有促进肿瘤发展和预测预后的作用。

总结：

总的来说，得益于单细胞测序技术的发展使研究人员可以从单细胞水平研究肿瘤微环境异质性。小编以以上四篇文章为例介绍了单细胞测序在胃癌研究中的应用。这四篇文章从不同角度研究了胃癌肿瘤微环境和细胞的异质性，分析内容丰富且较为常规，小伙伴们快来学习起来吧~

参考文献

1. Single-cell RNA sequencing reveals a pro-invasive cancer-associated fibroblast subgroup associated with poor clinical outcomes in patients with gastric cancer

2. Single-cell landscape reveals active cell subtypes and their interaction in the tumor microenvironment of gastric cancer

3. Revealing the transcriptional heterogeneity of organ-specific metastasis in human gastric cancer using single-cell RNA Sequencing

4. Integrated Single-Cell RNA-Sequencing Analysis of Gastric Cancer Identifies FABP1 as a Novel Prognostic Biomarker