大家好，今天给大家分享的是2022年6月份发表在Nature Medicine（IF=87.2）的文章。本文是由多个重点血液病研究中心的研究者集思广益，阐述了白血病异质性和预测药物反应之间的相关性。

A cellular hierarchy framework for understanding heterogeneity and predicting drug response in acute myeloid leukemia

理解急性髓系白血病异质性和预测药物反应的细胞层次框架

研究背景：急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种破坏性疾病，其特征是患者间和患者中广泛异质性。预后不佳的原因是首次化疗耐药和获得缓解的患者高复发率，这凸显了普通化疗对治疗大多数AML存在不足。最近，许多针对不同细胞机制的新疗法已获批或正在进行临床试验，为化疗提供了替代方案。然而，患者对这些新疗法的反应也是不同的，缺乏为每个患者选择最佳疗法的可靠方法。前期很多研究形成了AML是由罕见白血病干细胞（LSCs）维持的证据。自那以后，LSCs被证明可介导复发，基于LSCs的基因表达干性已成为化疗预后预测因子。虽然LSCs是一个重要治疗靶点，但该模型在治疗选择方面提供了有限指导。长期以来，癌症一直被认为是正常组织发育的缩影，而AML是研究的最好的癌症系统，在这个系统中，白血病细胞被认为是一个类似于正常血液发育的层级。AML中细胞层次以不同方式扭曲，这取决于它们基因改变和细胞起源。每个患者白血病细胞组成可能反映了疾病LSCs上特定突变的功能后果。因此，对白血病层次的探究可能为整合AML遗传和干细胞模型提供了一个潜在机会。单细胞RNA测序（Single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）已成为解剖细胞层次结构的有力工具。在这项研究中，使用不同AML干细胞、祖细胞和成熟细胞类型的单细胞图谱，通过在AML转录组上的基因表达反卷积，对1000多名AML患者的细胞层次结构进行了描述。这种描述AML异质性的方法使AML基因组和干细胞模型得以整合，从而为理解疾病生物学和预测药物反应提供了一个新框架。

摘要：AML治疗前景正在发生变化，较有前途的治疗方法进入临床转化，但患者反应仍不一致，缺乏针对特定治疗的生物标志物。为了了解疾病异质性与治疗反应之间的联系，作者使用白血病干细胞、祖细胞和成熟细胞类型的单细胞图谱，通过反卷积方法，从1000多名患者转录组数据中确定了白血病细胞层次结构。白血病等级组成与功能、基因组和临床特性相关，共聚合为四个总体级别，跨越原始、成熟、GMP和中级。关键的是，沿着原始与GMP轴或原始与成熟轴层次组成变化分别与化疗反应或靶向治疗药物敏感性相关。来自原始和成熟轴的7个基因生物标志物与105种药物反应相关。细胞层次构成为理解AML疾病生物学和推进精准医学提供了一个新框架。

结果：

1.白血病干细胞和祖细胞的异质性。

作为揭示AML中细胞层次结构的第一步，作者重新分析了12名诊断为AML的13653个细胞scRNA-seq，重点关注原始干细胞和祖细胞群（白血病干细胞和祖细胞（leukemia stem and progenitor cells，LSPCs））。作者先前确定了两种正常人类造血干细胞转录组群体：一种是转录组多样性低的深度静止群体，另一种是CDK6表达较高的较浅静止状态。作者对LSPCs进行分析确定了12例患者共属于3个不同亚群（图1a）。一个亚群转录组多样性较低，在核心LSC程序中富集，但在其他方面表现为不活跃，将这个亚群命名为静止LSPC。第二个亚群CDK6和E2F3靶点富集，提示细胞周期启动以及炎症特征提示骨髓分化启动，将这个亚群命名为Primed LSPC。第三亚群表现为富集CTCF靶点提示干细胞激活和广泛富集E2F靶点表明细胞周期进展（图1b）。接下来作者试图了解这些已定义的AML细胞群及其组织层次是如何与AML功能、生物学和临床特性相关的。使用基因表达反卷积从AML转录组推断白血病等级组成（图1c）。因此，作者对先前通过微阵列评估的111个AML片段进行RNA-seq，其中通过异种移植确定了LSC活性，并应用反卷积确定每个片段细胞类型组成（图1d）。静止LSPC和启动LSPC的LSC+组分高度富集，而循环LSPC则不富集（图1e）。相反，单核样细胞LSC-组分高度富集（图1e）。鉴于免疫表型不能一致性预测LSC活性，作者通过训练分类器预测AML分型中基于细胞类型组成和CD34/CD38状态的LSC活性，从而将反卷积与免疫表型进行比较。在免疫表型上训练分类器始终优于在白血病细胞组成上，甚至优于以静态LSPC丰度作为单一变量训练模型（图1f）。最后，在一个独立大量AML样本数据集中，通过限制性稀释分析评估发现，静止LSPC与高LSC频率相关（图1g）。总的来说，这些发现在转录组LSPC状态和位于白血病细胞等级顶端的功能性LSCs之间建立了一种新联系，表明LSC活性可以通过患者等级反卷积推断出来。

图1 scRNA-seq中LSPC的功能意义。a，4163个AML LSPCs图。b，TF在每种白血病细胞类型中的调节活性。c，来自scRNA-seq参考特征AML反卷积方法示意图。d，评估来自scRNA-seq的AML细胞状态与功能性LSC活性之间关系的实验设计。e，72个LSC+和38个LSC− AML片段的白血病细胞类型富集。f，预测110个已排序的AML组分中功能性LSC活性的RF分类器模型性能。g，在Pabst等人定义的低、中和高LSC频率的患者样本中，静止LSPC的相对丰度。

2.层次组成与AML基因组学相关。

维持患者AML的LSCs分化特性反映在它们细胞组成中。为了研究这些层次如何在患者样本中变化，以及它们如何与AML分子和临床特征相关，应用反卷积方法，从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、BEAT-AML和白血病基因队列的864例患者样本中推断7种白血病细胞类型和7种非白血病免疫群体丰富度。基于患者白血病细胞层次结构聚类发现显示四种不同亚型：原始（浅层，LSPC富集），成熟（陡峭层，富集成熟单核样和cDC样细胞），GMP（以GMP样细胞为主）和中间（均衡分布）（图2a-c）。患者层次是沿着两个主成分分离的：PC1，跨越从原始到GMP的连续统一体；PC2，跨越原始到成熟（图2a）。由细胞遗传学改变产生的层次结构主要沿着原体与GMP轴分离PC1，其中，不利的细胞遗传学改变产生原始层次，有利的细胞遗传学改变产生GMP优势层次（图2d）。由基因驱动突变及其组合产生的细胞层次结构主要沿着原始轴与成熟轴PC2分离，反映了它们对AML分化程度的影响（图2e）。与观察到的有利和不利细胞遗传学相关，不同等级亚型患者生存结果也不同，其中原始等级与较差结果相关，而GMP优势等级与较好结果相关。这些数据表明，通过分层组成描述AML患者间异质性可以捕获并潜在整合AML异质性基因组和干细胞模型。现有AML预后评分与这一特定轴相关，指出了决定分层组成的生物学特性的重要性。

图2 AML层次组成与基因组学和生存率相关。a，基于其细胞层次的结构组成，对864例来自TCGA、BEAT-AML和白细胞基因队列的AML患者进行PCA分析。b，每个患者中每种白血病细胞类型的相对丰度。c，描述原始、GMP和成熟层次结构的细胞组成。d，沿着原始-GMP轴（PC1）描述细胞遗传群的密度图。细胞遗传学改变以预后意义着色，其中红色表示预后不良，绿色表示预后良好。e，沿着原始与成熟轴（PC2）描述常见驱动突变组合的密度图。f，TCGA和BEAT-AML队列中AML分级亚型的总生存期结果。g，针对三个患者队列中每种AML分级亚型的单变量和成对HRs。

3.诊断与复发之间的层次结构变化。

鉴于在AML中观察到分级组成和临床结果之间的关联，作者考虑这些分级组成是否随着疾病发展而演变。为了了解AML分级在疾病发展过程中的变化，作者对从四个独立队列中收集的诊断和诱导化疗后复发的44对AML样本进行反卷积分析（图3a）。在诊断时，患者表现出不同层次组成，但由于复发，大多数患者原始LSPC显著增加，特别是静止LSPC（图3c）。为了在单细胞水平上验证这一发现，作者分析了8例复发AML患者的scRNA-seq数据，并观察到与12例诊断性AML样本的scRNA-seq数据相比，都存在一致较高的LSPC丰度（图3d）。尽管复发时LSPC扩张与先前功能性异种移植研究一致，为了验证这一发现，作者还评估了来自分子特征数据库（Molecular Signatures Database，MSigDB）的12441个生物特征，涵盖生物途径、免疫过程和癌症/AML特异性基因集，发现复发时总LSPC的富集比来自MSigDB的顶级特征显著两个数量级（图3e）。从诊断到复发这些细胞组成变化也有助于了解AML的克隆进化模式。例如，在NPM1突变AML中，FLT3-ITD改变在复发时反复获得，而NRAS和FLT3-TKD的改变在复发时反复丢失。事实上，带有NPM1c的FLT3-ITD产生了原始层次结构（图3f），而带有NPM1c突变NRAS或FLT3-TKD产生了成熟层次结构（图3g）。对于分析的其中一个患者子集，从诊断到复发的层次组成变化与克隆进化模式一致（图3h）。在没有明显遗传变化的情况下发生了等级结构变化，这可能是由于非遗传进化模式（图3i）。总之，研究结果确立了LSPC扩张是AML化疗后复发的不同进化路径的共同标志。

图3 从诊断到复发的层次结构转变。a，来自4个独立队列的44个配对AML样本从诊断到复发层次组成转变。b，描述从诊断到复发层次亚型分布图。c，44对诊断和复发患者之间白血病细胞类型丰度变化，包括总LSPC丰度。d，12个诊断性AMLs的scRNA-seq，与8个复发性AMLs的scRNA-seq比较。e，对照MSigDB中的12441个特征，对从诊断到复发层次结构变化的显著性和量级进行分析。f，伴有NPM1c+FLT3-ITD改变的患者复发时扩大。g，同时发生NPM1c+NRAS或NPM1c+FLT3-TKD改变的患者，复发时丢失。h，i，从诊断到复发克隆和细胞类型组成变化。克隆组成和细胞类型组成发生一致变化患者（h），以及细胞类型组成发生实质性变化的患者（i），与已知驱动突变相比，克隆组成检测到的变化极小。

4.原始和成熟轴捕获体外药物敏感性。

已经证明化疗后生存结果与层次组成（即原始与GMP轴）有关，作者考虑具有不同细胞组成的AML样本对新研究疗法的脆弱性是否不同。来自两个公共数据集的体外药敏数据与细胞类型丰度整合，生成每种白血病细胞类型的药敏概况（图4a）。这揭示了原始细胞和成熟细胞之间药物反应的巨大差异，药物反应分离主要发生在原始和成熟轴上，其中PC2显著相关，对37种BEAT-AML筛查药物和64种单独筛查药物均有应答（图4b）。通过LASSO回归对PC2上LSC17基因进行再训练，确定一个7基因谱系分类亚评分（图4c）。在验证队列中，LinClass-7与PC2相关性良好，并与33种BEAT-AML药物以及Lee等人的72种药物敏感性显著相关（图4d），每种药物靶点都是原始细胞或成熟细胞（图4e）。相比之下，LinClass-7高（原始>成熟）AML患者从吉妥珠单抗中没有获得明显生存好处（图4f）。值得注意的是，作者观察到吉妥珠单抗靶蛋白CD33表达水平与LinClass-7（图4g）或PC之间没有关联，并发现大多数患者无论哪种层次亚型都表达CD33+（图4h）。总之，数据证明了一个概念，即基因表达评分很容易生成捕获白血病层次组成的变化轴，这些可能代表对非化疗药物反应的强大生物标志物。它们也是为数不多的可广泛应用于成人和儿童AML的生物标志物之一。

图4 AML分级组成是靶向治疗反应的决定因素。a，在202例BEAT-AML患者样本中，细胞类型丰度和体外药物敏感性之间的相关性。b，原始轴与成熟轴（PC2）之间的相关性，与BEAT-AML筛查体外药物敏感性相关，识别出优先靶向原始或成熟AML细胞的药物。c，LinClass-7捕获原始与成熟轴。d，与LinClass-7的相关性确定靶向BEAT-AML原始细胞或成熟细胞的药物以及单独原发性AML药物筛查。e，对于BCL2抑制剂维奈托克、低甲基化试剂阿扎胞苷、MEK抑制剂司美替尼和MTOR抑制剂依维莫司，LinClass-7高AMLs和低AMLs的药物敏感性。f，ALFA-0701试验亚组评估吉妥珠单抗。g，在23例多伦多PMH AML患者中，通过Pearson相关性评估LinClass-7与CD33之间缺乏相关性。h，151例TCGA患者CD33阳性率。

5.AML分级框架指导临床前药物研究。

为了了解药物治疗如何影响细胞组成，作者从Gene Expression Omnibus（GEO）和ArrayExpress的43个数据集中提取RNA-seq数据，对药物治疗前后测序的人类AML细胞进行反卷积（图5a，b）。UMAP显示药物治疗后细胞组成变化，并根据其诱导变化对治疗进行聚类分析（图5c，d）。在153种处理条件下，125种导致细胞类型组成发生显著变化。77个处理条件导致PC2显著增加，这可能反映了分化，但大多数处理导致了GMP样母细胞耗尽，少数处理导致更原始的静态LSPC或启动LSPC群体耗尽（图5d）。例如，ATRA诱导的分化主要来自GMP样细胞（图5e）。相反，DHODH抑制剂布喹那诱导的分化伴随着静止LSPC丰度而降低，这表明该药物可能更好地耗尽干细胞库（图5e）。塞利尼索一种靶向核输出蛋白XPO1的药物（图5f）。在单细胞水平，XPO1表达和核输出过程在cycle LSPC群中富集（图5g），该细胞群丰度与BEAT-AML筛选的体外塞利尼索敏感性相关（图5h）。值得注意的是，在不同遗传背景下，用塞利尼索处理原发性AML样本会导致体内外循环LSPC群耗尽（图5i，j）。总之，这些数据阐明药物治疗后细胞组成的变化，并为临床前设置候选药物优先级提供了功能相关解读。

接下来的问题是：如何在更接近临床转化的临床前研究中使用层次分级，例如在体内药物反应背景下。作者使用了两种药物患者源性异种移植（patient-derived xenograft，PDX）反应数据：菲卓替尼（一种已批准的用于骨髓增生性肿瘤的JAK2抑制剂）和CC-90009（一种诱导小脑介导的GSPT1降解的免疫调节剂）。在658例接受药物治疗或对照PDX接受者中，AML样本接受治疗。来自异种移植前原发患者样本的反卷积RNA-seq根据层次组成进行聚类，分为原始、中间/GMP或成熟（图6a，b）。菲卓替尼主要靶点JAK2主要在单核细胞样和cDC样细胞中表达（图6c）。反过来，这些成熟细胞在菲卓替尼体内反应良好的患者样本中富集（图6d）。对菲卓替尼反应的亚组分析显示，在成熟层次AMLs中有效率较高，而在其他层次亚型AMLs中有效率较低（图6e）。CC-90009靶蛋白GSPT1在循环LSPC和GMP样细胞中高表达（图6f）。反应者中GMP样细胞扩增，而部分反应者和无反应者中静止LSPCs扩增（图6g）。亚组分析显示CC-90009对成熟和中间/GMP层次的AMLs有较高疗效。相比之下，具有Primitive层次结构的小鼠异质性反应率为40%（图6h）。为了更好地理解患者样本对菲卓替尼和CC-90009异质反应，比较了菲卓替尼和CC-90009治疗条件下有反应和无反应的AML样本基因组特征。在原始AML层次中，NPM1c突变与菲卓替尼良好反应和CC-90009不良反应相关，而缺乏NPM1c突变的原始AML表现出CC-90009良好反应和菲卓替尼不良反应（图6e，h）。因此，来自8例具有不同层次组成的AML患者PDX异种移植模型分别接受两种药物单独或联合治疗。尽管对单一药物反应各不相同，但8例患者中有7例PDXs对联合治疗和消除白血病完全有效（图6i）。总的来说，在PDX模型中，对菲卓替尼、CC-90009和联合治疗的应答均与层次组成显著相关（图6j）。这些数据表明，通过等级组成对AML进行分层可以帮助确定可能从特定治疗中受益的患者样本，同时也为基于等级靶向显示互补性药物配对设计联合方案提供了证明。

图5 药物治疗后细胞组成变化。a，从文献中重新分析临床前的实验设计。b、再分析方法示意图。c，根据细胞类型组成变化对药物治疗进行聚类。d，描述每个簇内药物治疗后细胞类型组成变化热图。e，针对特定过程药物治疗的例子以及治疗后每种细胞类型丰度的变化。f，体外塞利尼索处理NPM1突变AMLs后细胞组成的变化。g，XPO1（塞利尼索的靶点）及其相关基因和通路在scRNA-seq的AML blast亚群中的平均表达量。h，在202例有塞利尼索敏感性报道的BEAT-AML诊断样本中，40例细胞类型丰度与体外药物敏感性之间的相关性。i，体外用DMSO对照或塞利尼索处理的三个AML原始样本LSPC-Cycle丰度。j，在体内用DMSO对照或塞利尼索处理的三个原发性AML样品中LSPC-Cycle丰度。

图6 基于层次分层预测体内对菲卓替尼和CC-90009的反应。a，在PDX模型中评估AML层次组成与药物反应之间关系的实验设计。b，在体内药物治疗前原发患者样本的层次组成。c，菲卓替尼靶点JAK2在scRNA-seq AML blast亚群中表达。d，对菲卓替尼有反应者和部分/无反应者之间细胞类型丰度的差异。e，按白血病等级亚型分层分析菲卓替尼异种移植反应。f，CC-90009靶点GSPT1在scRNA-seq AML blast亚群中表达。g，CC-90009反应者和部分/无反应者之间细胞类型丰度的差异。h，按白血病等级亚型分层分析CC-90009的异种移植反应。i，按等级分层分析菲卓替尼+CC-90009联合治疗的反应。j，菲卓替尼、CC-90009及联合治疗异种移植AML患者的体内疗效。

结论：总的来说文章研究表明，专注于每个白血病患者细胞层次结构组成的生物标记物具有强大潜力来指导这些疗法的开发和选择，从而为AML精准医疗框架奠定基础。

参考文献：Zeng A G X, Bansal S, Jin L, et al. A cellular hierarchy framework for understanding heterogeneity and predicting drug response in acute myeloid leukemia[J]. Nat Med. 2022,28(6):1212-1223.