聚类分型的文章见的实在是太多了,大家好像都有一个疑问,我分了型能用到临床吗?实际遇到一个患者,我怎么知道他属于哪一个类型?很遗憾告诉你,不能!除非手握大样本量real world队列。能够实际应用的常见类型就是模型构建和maker筛选,所以这也是为什么很多文章在聚类分型之后构建预后模型,就,它可以实际应用啊。但是,今天小编要为聚类分型一“分”到底的文章正名,纯生信不要实验!
这是一篇七月底发表在Frontiers in Immunology(IF:8.786)杂志上的肝癌单细胞拟时序亚型的纯生信文章,文章主要方法包括无监督聚类、单因素及多因素cox分析、WGCNA及功能富集分析等经典的生物信息方法。然而,不同于多数聚类分型的分析,文章在单细胞转录水平描述了免疫细胞的景观,并确定了参与CD8+T细胞动态进化的轨迹基因,由此识别了肝细胞癌的三种亚型并进行刻画。文章的研究角度很棒,感兴趣的小伙伴不要错过呀。
CD8+ T cell trajectory subtypes decode tumor heterogeneity and provide treatment recommendations for hepatocellular carcinoma
CD8+T细胞轨迹亚型可以解码肿瘤的异质性,并为肝细胞癌提供治疗建议
背景
肝细胞癌(HCC)是一种常见的肝脏恶性肿瘤,在全球发病率方面排名第六,是全球死亡率的第二大原因。HCC主要是由一系列慢性肝病引起的,如肝硬化、HBV/HCV感染和脂肪肝疾病。目前,常用的治疗方法包括根治性手术、经导管动脉化疗栓塞(TACE)、分子靶向药物和免疫治疗。然而,由于其较强的侵袭能力和高复发率,HCC患者的预后较差,5年生存率只有18%。此外,以往的研究表明,即使是相同临床阶段的患者,在治疗效果和预后表现上也存在差异。这主要是因为广泛使用的临床分类系统侧重于临床病理特征,却忽略了它们的分子特征。因此,增加对基因组异质性的认识是非常必要的。寻找一种新的分子分类对患者的分层和临床决策具有重要意义,从而进一步改善预后。
在此,作者根据单细胞RNA-seq数据,描述了免疫细胞的景观,并确定了参与CD8+T细胞动态进化的轨迹基因。随后,基于TCGA-LIHC队列识别了三个异质性集群,并使用独立的外部队列进行验证。三个集群具有明显的预后、生物学特征、基因组变异和免疫浸润微环境。此外,对使用不同临床治疗队列的HCC患者提出了治疗建议,包括免疫治疗、TACE和索拉非尼治疗。在这三个集群中也确定了潜在的治疗药物。总的来说,三个组的患者表现出不同的治疗反应,这为制定个体化治疗策略提供了理论基础。
本研究共收集并处理了15个独立的公共数据集,包括单细胞RNA-seq队列、高通量RNA-seq队列、微阵列队列和临床治疗队列。使用单细胞RNA-seq队列GSE140228展示了HCC的免疫景观和动态。
结果
单细胞数据展示细胞亚型
为了描述CD45+免疫细胞的景观和动态,作者进行单细胞转录组亚聚类分析,采用t-SNE的方法进行可视化。共有来自肿瘤和正常组织的3817个免疫细胞被分为17个簇(图1A)。根据不同亚簇的基因特征,这些细胞主要由5个免疫细胞簇组成,包括B细胞、树突状细胞、单核细胞、自然杀伤细胞和T细胞(图1B)。为了描述免疫细胞的来源,作者分别聚集了2212个肿瘤来源细胞和1605个非肿瘤来源细胞(图1C)。单细胞富集分析显示,所有的细胞都参与了免疫炎症途径,特别是树突状细胞、单核细胞和T细胞(图1D)。作者进一步分析了百分比组成,并提取了每个免疫细胞簇的前5个标记物(图1E,F)。值得关注的是,T细胞是肿瘤组织最普遍的细胞簇。众所周知,T细胞具有抗肿瘤免疫能力和在肿瘤进展过程中直接杀死细胞的能力。因此,作者在单细胞水平上进一步探索和解码T细胞。
图1
在HCC进展过程中T细胞的动态变化
进一步揭示T细胞的进化。所有的T细胞再次聚集,并分为6个细胞亚群(图2A)。先前的研究表明,CD3D和CD3E是CD4+和CD8+T细胞的共享基因标记物,因此,作者的研究提示,本研究中获得的T细胞主要由CD4+和CD8+T细胞组成(图2B,C)。特异性标记基因CD4在聚类1、2、3和5中表达,表明这些聚类代表CD4+T细胞(图2D)。作者还注意到,簇0和簇4富集了CD8+T细胞标记物,如CD8A和CD8B,证实了CD8+T细胞的身份(图2E,F)。进一步研究了CD8+T细胞中的免疫检查点,其中大多数抑制性检查点代表T细胞衰竭,如HAVCR2(TIM3)、LAG3、TIGIT、PDCD1(PD-1)和CTLA-4,这些检查点在CD8+T簇2中显著上调(图2G)。拟时间和轨迹分析显示,CD8+T细胞随着肿瘤进展而趋于耗尽,这可能与不良预后有关(图2H,I)。先前的一项研究也表明,T细胞排斥在TME中很常见,并与免疫特权相关。因此,这些沿着运动轨迹的基因可能在TME和HCC患者的临床结局中发挥重要作用。
图2
三个分子亚型的鉴定
基于轨迹基因识别与预后相关的候选基因。基于这些基因的表达,作者利用NMF方法来识别异质分子亚型(图3A-C)。为便于临床应用,作者进一步探讨了集群的预后意义。C2的总生存率(OS)和无复发生存率(RFS)较差,而C3预后较好(图3D,E)。
图3
亚型的特征基因和特定途径
利用WGCNA软件包对三个亚型的特征基因进行了鉴定。当β设置为6时,无标度R2为0.9,构建了无标度网络(图4A)。此外,还展示了模块-特征关系来测量模块和三个聚类之间的相关性。绿松石色、蓝色和紫色模块分别与C1、C2和C3的相关性最强(图4B)。基因显著性与模块隶属度之间的相关性值表明,基因模块的构建是稳健的(图4C-E)。为了探究三个亚型的特定生物学特征,进行GSEA分析(图4F,G)。基于功能富集结果,将C1描述为脂质代谢的HCC,C2描述为细胞增殖的HCC,而C3被定义为免疫性炎症性HCC。
图4
亚型验证
使用NTP方法,从不同平台获得多个队列,测量和评估每个患者的预测置信度(图5A,C)。KM分析显示,C2仍然具有最不利的OS,而C3则具有最有利的OS,这与之前的结果一致(图5B,D)。多因素Cox回归分析显示,C2是TCGA-LIHC、GSE14520和ICGC-LIRI队列的独立预后指标(图5E-G)。此外,三个亚型在不同队列中的比例显示出很高的相似性(图5H)。总的来说,这三个亚型的临床结果存在异质性,并且在HCC中具有可重复性和稳健性。
图5
基因组变异景观
作者进一步描述了三个亚型之间的基因组变异景观。如图6A所示,显示了前20个常突变基因(FMGs)的突变频率、SNP、INDEL和TMB。为了增加对体细胞突变的理解,作者比较了3个亚型中20个FMGs的突变差异(图6B)。引人注目的是,在所有分子簇中都显示出三个普遍的FMGs,包括TP53、CTNNB1和TTN,这表明这些FMGs可能在肿瘤发生或肿瘤进展中发挥关键作用(图6B)。在3个FMG中,CTNNB1和TTN在C1中突变明显,而TP53突变在C2中占优势。C3的基因突变相对于其他基因突变最低,这意味着更好的临床结果。作者进一步探索了CNV,并描述了三个亚型中常见的前10位AMP(扩增)和HOMDEL(纯合删除)的基因(图6C)。有趣的是,与其他集群相比,C2的CNV值更高,而CSMD1基因的CNV缺失最为明显(图6C)。总的来说,C2患者表达了显著的基因组变异,表明了高度的基因组不稳定性。
图6
免疫浸润和免疫治疗的评估
以上结果提示C3患者可能获得更好的免疫治疗效果。因此,作者描述了免疫细胞浸润和免疫检查点表达的景观以分析潜在的机制。与其他亚型相比,C3表现出更多的免疫细胞浸润丰度(图7A),也表现出最高的免疫检查点表达,如CD274(PD-L1)、CTLA-4和LAG3,提示C3可能对免疫检查点抑制剂(ICI)治疗更敏感(图7B)。此外,C3中HLA分子的表达明显升高,这证明C3患者具有较强的抗原呈递能力(图7C)。总的来说,精确免疫治疗可能适用于C3型患者。
为了对免疫治疗进一步探索,作者应用TIS和Submap方法来评估不同亚型之间的临床疗效。与预期的一样,C3的TIS评分最高,提示免疫激活和对ICIs的反应升高(图7D)。基于Submap算法,C3患者与对PD-L1抑制剂有反应的患者的表达模式具有高度相似性,表明抗PD-L1治疗更受益(图7E)。随后,提取C3的特征基因作为测量评分,命名为聚类相关免疫治疗评分(CAIS)。值得注意的是,在所有队列中,高得分组患者对免疫治疗均表现出良好的反应(图7F,G)。综上所述,上述数据表明CAIS是一个稳健且有前途的免疫治疗指标,建议C3型患者予以考虑使用免疫治疗。
图7
临床治疗和潜在治疗药物评估
根据更新的临床指南,推荐对初发期患者采用TACE治疗。与此相一致,以上结果也表明C1和C3患者对TACE治疗有理想的疗效(图8A)。在三个组中进一步评估了索拉非尼的治疗敏感性,证实C2患者可以获得更多的临床效益(图8B)。在TCGA-LIHC队列中,C2患者对nilotinib和bosutinib也表现出更优越的反应(图8C,D)。此外,C1患者可能对较低的半抑制浓度值对阿西替尼更敏感(图8E)。此外,展示了20种具有个性化治疗潜力的化合物(图8F),并描述了这些化合物的靶向途径,可用于开发多种药物(图8G)。
图8
小结
这篇文章揭示了HCC的肿瘤异质性,并区分了HCC的三个亚型。在这三个亚型之间有不同的分子特征,它们有不同的临床结果,生物学特征、基因组变异、免疫景观和治疗反应。建议C1组患者接受TACE治疗,鼓励C2组患者接受TKI治疗,而建议C3患者进行免疫治疗。相比于其他聚焦基因水平的分型文章,该研究以单细胞数据切入,以T细胞的拟时序轨迹为关注点,区分肿瘤亚型,进行细致的解析刻画,小编觉得是一个不错的学习思路。